超聲振蕩改性玉米醇溶蛋白及高F值寡肽制備

李婷婷，田亞平*，周楠迪，孫付保，王志翠

（1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.紐綏笙特殊醫用食品江蘇有限公司，江蘇泰州225300）

玉米醇溶蛋白（Zein），其含量位居玉米蛋白首位，約占比60%[1]；其具有成膜、黏結、生物降解和抗氧化等特性，被用于制作保鮮、藥物緩沖、活性包裝等材料[2]，但以其為原料酶法制備活性肽就需要解決其易形成“粘彈性面筋團”的現象[3]；其富含異亮氨酸、亮氨酸，缺乏色氨酸，是用于生產高F值寡肽的優質天然蛋白質[4]。

高F值寡肽，其為一類混合物，相對分子質量為200～1 000；其組成獨特，F值大于20，苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）含量不超過2%[5]；其較氨基酸產品更易被生物體利用[6-7]。其中，F值為支鏈氨基酸（BCAA）的摩爾數比芳香族氨基酸（AAA）的摩爾數[8]。大量研究表明，高F值寡肽不僅可以緩解肝性腦病，還具有解醉酒[9]、增強記憶[10]、抗疲勞[11]、抗氧化[12]及防衰老[13]等功效。早在20世紀70年代，Yamashita等[14]制得Phe含量低的肽，從此掀起了國內外對高F值寡肽的研究熱潮。

本研究旨在借助超聲協同振蕩手段破壞蛋白質分子間作用力，使其緊致結構及聚集程度得到有效改善[15-17]，解決其在加熱溫度超過玻璃化轉變溫度（Tg）會聚成面團的現象[18]，易于蛋白酶作用[16，19]，為有效利用其天然優勢且高效制備高F值玉米寡肽提供有利條件，進而推動高F值寡肽的商品化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白：武漢遠成共創科技有限公司；Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶：諾維信（中國）生物技術有限公司；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶：生工生物工程（上海）股份有限公司；α-胰凝乳蛋白酶：美國Amresco公司；羧肽酶A：美國Sigma公司；活性炭：寧夏天福盛園建設安裝有限公司。

1.2 儀器設備

KX-85-2A數顯恒溫磁力攪拌器：金壇市科析儀器有限公司；超聲振蕩儀、真空冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；UF101超濾納濾裝置：上海弗立特實業有限公司；NEXUS傅里葉變換紅外光譜：美國尼高力儀器公司；差示掃描量熱儀（DSC 204F1）：德國耐馳儀器制造有限公司；高速低溫離心機、SU1510掃描電鏡（SEM）、SU8220冷場發射掃描電鏡（FESEM）：日本日立HITACH集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白的預處理

1）各預處理方式對宏觀形態的影響 配制50 g/L的懸浮液，pH調至9.5。分別采用50℃水浴、亞硫酸鈉、吐溫、聚乙二醇、皂素、丙三醇、十二烷基磺酸鈉（SDS）、225 W超聲振蕩的方式進行90 min預處理，以50 g/L玉米醇溶蛋白懸浮液在高于玻璃化溫度卻不聚成團為指標，選擇最佳預處理方式。

2）超聲振蕩對熱穩定的影響 在張等[20]的測定方法上稍有改良，固態樣品的掃描范圍為30～200℃；50 g/L懸浮液的掃描范圍為20～80℃。Tg的計算參考卞[21]的方法。

3）超聲振蕩對微觀表面形貌的影響 取少量待測固態樣品固定在樣品臺上，噴金鍍膜處理，在高真空、5 kV的環境下，采用SEM在1 000、5 000倍下觀察其微觀表面形貌在超聲處理前后的變化。

用體積分數70%乙醇配制2 mg/mL質量濃度的待測樣品，取少量滴于硅片上，自然干后固定在樣品臺上，噴金鍍膜處理后采用FESEM放大10 000倍，在高真空、3 kV的條件下觀察其微觀表面形貌在超聲處理前后的變化。

4）超聲振蕩對結構的影響 參照董等[22]的測定方法。

1.3.2 玉米粗肽的制備

1）蛋白酶的選擇 將預處理后的玉米醇溶蛋白懸浮液分別調至各內切酶最適的反應溫度、pH條件，均以1×104U/g的酶底比加入各內切酶且反應2 h。利用水解度（DH）、游離態BCAA和AAA含量作衡量參數，選擇制備玉米粗肽（肽含量高且氨基酸組成特殊）的最佳蛋白酶。

2）Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶水解條件的優化將超聲振蕩后的懸浮液調至50℃，pH調至8.0，分別以1×104、2×104、3×104、4×104、5×104U/g的酶底比添加Alcalase 2.4L堿性蛋白酶，反應4 h，通過控制DH和蛋白質質量濃度，對該酶的最佳酶底比和反應時間進行優化。

3）酶解液的膜過濾 將酶解液加入超濾納濾系統，選擇操作壓力為0.25 MPa，經超濾（5 000）和納濾（500）收集相對分子質量500～5 000的混合肽，冷凍干燥后進行氨基酸測定和相對分子質量分析。

1.3.3 高F值玉米寡肽的制備將膜過濾得到的凍干粉配制成50 g/L的玉米粗肽溶液，溫度維持在40℃，pH調至8.0，按酶底比2.0×104U/g加入α-胰凝乳蛋白酶，水解4 h；然后溫度調至37℃，pH調至7.0，按酶底比40 U/g加入羧肽酶A，水解2 h，然后進行10 min的90℃酶失活處理；調pH至2.5，按炭液比為1∶15加入改性活性炭，調轉速至160 r/min，25℃處理2 h，然后離心取上清液，經冷凍干燥后進行氨基酸和相對分子質量的測定。

1.3.4 水解度測定采用甲醛滴定法，參照Wang等[23]的測定方法。

1.3.5 蛋白質質量濃度測定采用BCA法微量測定，按照BCA試劑盒的說明書進行標準曲線的制定及待測樣品的多肽質量濃度測定。其中，反應溫度為37℃，反應時間為30 min，檢測波長為562 nm。

1.3.6 多肽分布測定參照齊等[24]的測定方法進行待測樣品的多肽相對分子質量分布測定。

1.3.7 氨基酸質量濃度測定游離態氨基酸參照朱等[25]的方法，總氨基酸參照尹等[26]的方法。

1.3.8 產品得率計算為保證工業轉化的高質量運行，則對小試階段的產品得率（Y）進行計算，公式如下：

式中，Y為產品得率（%）；m1為高F值玉米寡肽質量（g）；m2為玉米醇溶蛋白質量（g）。

1.4 數據處理

實驗中所有數據均進行3次平行測定，使用SPSS 18.0軟件進行數據分析，以平均值±標準誤差表示結果，采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 玉米醇溶蛋白的預處理

2.1.1 各處理方式對宏觀形態的影響Tg是非晶態高聚物的重要特征溫度之一，是從玻璃態轉變為高彈態的溫度，是影響性能的主要因素[27-29]。由DSC圖譜可知，50 g/L玉米醇溶蛋白懸浮液的Tg為34.8℃（圖1（a））；固態玉米醇溶蛋白的Tg為107℃（圖1（b）），高于其50 g/L懸浮液的Tg，因為Tg與樣品含水量呈負相關[18，30]；其Tg在超聲振蕩前后沒有顯著變化，而超聲振蕩后變性峰顯著減弱（圖1（b）），可能因為超聲協同振蕩的空化與剪切作用削弱了蛋白質的聚集程度而使其變得分散[31]。

圖1 超聲振蕩前后玉米醇溶蛋白的DSC圖譜Fig.1 DSC curves of zein before and after ultrasound oscillation pretreatment

作者發現50 g/L的玉米醇溶蛋白懸浮液在50℃加熱時會形成“粘彈性面筋團”（圖2（b）），因為其在溫度高于Tg時，會失去其固有結構，通過蛋白質的重排形成粘彈性體系[18]。該玉米醇溶蛋白懸浮液分別經亞硫酸鈉、吐溫、聚乙二醇、皂素、甘油、SDS處理后，再經過50℃加熱仍會聚成“粘彈性面筋團”（圖2（b））；但經超聲振蕩處理后，不僅解決了其在50℃聚成團的難題（圖2（d）），且其凍干粉（圖2（c））較原玉米醇溶蛋白（圖2（a））顯著松散，由顆粒狀轉變為粉末狀。結合DSC圖譜進行綜合分析，則本研究選擇超聲振蕩作為降低該蛋白質聚集程度的最佳處理方式。

圖2 不同預處理對玉米醇溶蛋白宏觀形態的影響Fig.2 Effects of different pretreatments on macroscopic morphology of zein

2.1.2 超聲振蕩對微觀表面形貌的影響從SEM和FESEM中觀察到：未經超聲處理的玉米醇溶蛋白呈“海帶”狀，連接緊密，韌性強，表面光滑（圖3（a）和3（b）），且蛋白質在70%乙醇中聚成球體，球的大小不等，球的頂端附有一層“薄膜”，球與球間連接緊密并盤旋成一團（圖3（c）），這些聚集體也許就是其加熱成團的結構基礎；經超聲振蕩處理后，其微觀表面形貌有顯著變化，由整體片狀型轉變為塊狀堆積形態，由韌性變得松散，且表面出現了許多微小孔洞，增加了許多小突起（圖3（d）和3（e）），且在70%乙醇溶液中分散較好，球直徑顯著變小，球大小較均一，球表面失去了“薄膜”而變得光滑，且球與球間失去了緊密的盤旋而呈線狀（圖3（f））。蛋白質松散度的提高為高效水解提供有利條件。超聲振蕩通過機械和空化作用、斷裂作用于蛋白質分子間的范德華力和氫鍵，破壞蛋白質分子之間的交聯[15，17]，這可能是玉米醇溶蛋白質的微觀表面形貌經超聲震蕩后顯著變化的根本原因，與DSC分析結果一致。

圖3 超聲振蕩前后玉米醇溶蛋白的SEM圖（a，b，d，e）和FESEM圖（c，f）Fig.3 SEM（a，b，d，e）and FESEM（c，f）images of zein before and after ultrasound oscillation pretreatment

2.1.3 超聲振蕩對結構的影響如圖4（a）所示，超聲處理前后的玉米醇溶蛋白在4 000～400 cm-1的FTIR中均出現特征吸收帶，但強度存在差異。其中，蛋白質的粘彈性和二級結構通常基于波數1 700～1 600 cm-1的FTIR分析（酰胺Ι帶）[32]，其特征振動主要是C＝O起作用，且1 610～1 640 cm-1是β-折疊區域，1 640～1 650 cm-1是無規卷曲區域，1 650～1 658 cm-1是α-螺旋區域，1 660～1 700 cm-1是β-轉角區域[33]。如圖4（b）所示，超聲振蕩前后的玉米醇溶蛋白在酰胺Ι帶的吸收波形一致，但吸收強度在經超聲振蕩后明顯減弱，這說明其二級結構經超聲振蕩后有很大程度的改變，但未被完全破壞。

圖4 超聲振蕩前后玉米醇溶蛋白的FTIR譜圖Fig.4 FTIR spectra of zein before and after ultrasound oscillation pretreatment

2.2 玉米粗肽的制備

2.2.1 蛋白酶的選擇選擇作用于AAA的蛋白酶、采用內外切酶協同水解是獲得高F值寡肽的關鍵。選用5種在AAA處有酶切位點的內切酶進行初步水解（表1），在打開緊致結構的同時避免產生過多的游離氨基酸[34]。如圖5（a）所示，DH從大到小依次為：D、A、E、C、B。游離態氨基酸含量由多到少依次為：D、A、E、C、B（圖5（b）），與DH排序一致，D水解物的游離態氨基酸為1.86 mg/mL，其中，BCAA為0.87 mg/mL，AAA為0.37 mg/mL，均高于A水解物（1.03、0.34、0.26 mg/mL），但游離態AAA/BCAA為0.42，低于A水解物（0.76），可能因為木瓜蛋白酶也具備外切酶的作用[35]。結合玉米醇溶蛋白的特性及各內切酶的作用特點，該步選用Alcalase 2.4L堿性蛋白酶進行初步水解。

表1 不同內切酶的作用位點Table 1 Action sites of different endoproteases

圖5 不同內切酶水解玉米醇溶蛋白的DH及游離態氨基酸質量濃度Fig.5 Degree of hydrolysis and free amino acids content of zein hydrolysed by different endoproteases

2.2.2 Alcalase 2.4L堿性蛋白酶酶解條件的優化在DH和蛋白質質量濃度雙指標的控制下，優化水解時間和酶添加量，以達到高水解度且肽含量高的目標。如圖6（a）所示，在其蛋白質質量濃度（50 g/L）恒定的條件下，隨著酶添加量的增大，活性基團增加，反應增速，DH增大，但蛋白質中可被酶作用的位點隨反應的進行而減少，當反應4 h時，水解過程基本達到飽和狀態，且以酶底比4×104U/g水解4 h的水解度（18.6%）與以酶底比5×104U/g水解4 h的水解度（19.66%）相近，而反應超過3 h后，蛋白質質量濃度迅速降低（圖6（b））。因此，選用4×104U/g的酶底比對該松散蛋白質進行3 h的水解反應，以保證得到肽含量較高的玉米粗肽。

圖6 Alcalase 2.4L堿性蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的蛋白質水解度和蛋白質質量濃度Fig.6 Degree of hydrolysis and protein concentration of zein hydrolyzed by alkaline protease（Alcalase 2.4L）

2.2.3 Alcalase 2.4L堿性蛋白酶酶解液的超濾納濾將得到的酶解液經超濾膜（5 000）和納濾膜（500）過濾，得到的粗肽中相對分子質量小于1 000的約占97.62%（圖7（a）和圖7（b））。其中，相對分子質量500～1 000的肽占10.33%，180～500的肽占57.56%，小于180的物質占29.73%（主要是二肽和游離氨基酸），見圖7（b）。同時對此粗肽進行氨基酸組成分析，見表2。總氨基酸質量分數為80.047 3%，游離態氨基酸8.924 9%且占比11.15%，結合圖7（b）分析，18.58%的小于180的物質可能是二肽；另外，此肽混合物中BCAA質量分數為20.818 7%，AAA總量為7.852 2%，F值為4.07，見表2。可用于高F值玉米寡肽的制備，此F值高于何等[36]水解大豆與玉米復配蛋白質制得的水解液的F值。另外，此粗肽混合物為短肽，便于α-胰凝乳蛋白酶協同羧肽酶A進一步的定向且高效酶解[37]。

圖7 粗肽的相對分子質量分布和比例Fig.7 Molecular weight distribution and content of crude peptides

2.3 高F值玉米寡肽的制備

表2 粗肽的氨基酸質量分數Table 2 Amino acid content of crude peptides %

按1.3.3所述方法制得高F值玉米寡肽混合物；以1.3.8所述公式算出此高F值玉米寡肽的得率為34.66%，高于林[38]制備高F值寡肽的得率，同時為后期工業化生產提供理論依據；以1.3.7所述方法進行氨基酸質量分數測定，見表3。此混合物中富含BCAA、AAA，被活性炭大量吸附，由7.852 2%降至0.42%，僅占氨基酸總量的0.73%，且F值由玉米粗肽的4.07提高到41.87，提高了10.29倍，高于使用這兩種酶水解大米[39]、螞蟥[40]、酪蛋白[41]制備高F值寡肽的F值。這一結果表明：此粗肽是制備高F值寡肽的優質肽源，此雙酶協同酶解能定向且高效釋放AAA，且AAA能被改性后的粉末活性炭高效除去。同時，以1.3.6所述方法進行多肽相對分子質量分布分析，見圖8。由圖8（a）可知，此混合物的相對分子質量主要集中于1 000以下，約占97.68%，其中180～1 000的肽占比71.37%（圖8（b）），此相對分子質量范圍的肽符合高F值寡肽的相對分子質量要求，且易被人體吸收利用。

表3 高F值玉米寡肽的氨基酸質量分數Table 3 Amino acid content of corn oligopeptides with a high Fischer"s ratio

圖8 高F值玉米寡肽的相對分子質量分布和百分比Fig.8 Molecular weight distribution and content of crude oligopeptides with a high Fischers ratio

3 結語

超聲振蕩使玉米醇溶蛋白的微觀表面形貌由片型韌狀轉變為塊型松散狀，蛋白球狀體的聚集程度減弱且球直徑變小，二級結構有一定程度的破壞等一系列的變化。結果說明超聲振蕩技術是通過改善玉米醇溶蛋白的結構特性而解決其加熱溫度高于Tg會形成“粘彈性面筋團”的現象。該蛋白質在結構松散狀態下易被Alcalase 2.4L堿性蛋白酶作用，提高了酶解效率，并通過超濾納濾膜分離、定向水解、活性炭脫芳香族氨基酸制得F值高達41.87，Phe和Tyr質量分數僅占氨基酸總量的0.73%，相對分子質量180～1 000占比71.37%的玉米寡肽。進一步研究的重點是通過動物實驗和臨床試驗研究該高F值玉米寡肽是否有糾正低蛋白血癥和預防早期肝損傷的功效，為來源于天然原料且具備特殊功效的高F值玉米寡肽的真正運用奠定基礎。