L-鼠李樹膠糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的應用

溫俊婷， 李子杰， 高曉冬*

（1. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

稀有糖（rare sugar）指自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物[1]。 目前已發現34 種稀有糖及糖醇[2]，包括D-阿洛酮糖、D-塔格糖、D-阿洛糖等。 稀有糖具有獨特的生物活性，可作為添加劑改善食品的理化性質[3]，發揮多種生理功能[4-5]，因此在食品、保健、醫藥等領域引起了廣泛關注。

D-阿洛酮糖（D-psicose）屬于稀有糖中的一種，其甜度為蔗糖的70%， 但能量僅為蔗糖的0.3%，具有低熱量的特性，可作為蔗糖的食用性替代物[6-7]。 隨著稀有糖研究的不斷推進，D-阿洛酮糖受到了廣泛的關注，其在醫療、保健方面具有顯著功效，如降血糖[8]、降血脂[9]，因而非常適用于糖尿病患者的食用[10]。另外，D-阿洛酮糖可以作為肝脂類酶[11]和腸道α-糖苷酶的抑制劑，減少脂肪堆積[12]，具有減肥功效。

D-阿洛酮糖在自然界中含量極少，主要存在于小麥、鼠刺植物以及甜菜糖蜜中[13-14]。 目前應用較廣泛的合成方法為化學合成法和生物合成法。 相較于化學合成法，生物合成法的優勢更為突出，例如反應條件溫和、副產物少、利于目的產物的純化，因此更適合工業化生產[15]。

目前最常見的酶法合成方法是利用D-阿洛酮糖-3-差向異構酶（D-psicose-3-epimerase，DPE）催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉化[16-17]。 但由于DPE 催化的異構化反應是一個可逆的過程， 所以D-阿洛酮糖的產率較低[18]。 因此，如何提高異構化反應的轉化率是生產D-阿洛酮糖所面臨的重大挑戰。

L-鼠李樹膠糖激酶 （L-rhamnulose kinase，RhaB）是己糖激酶-hsp70-超蛋白家族成員[19]，其N端結構域是ATP 的結合位點， 可以控制ATP 的結合過程。 RhaB 是一種底物特異性激酶[20]，同時也是大腸桿菌體內代謝L-鼠李糖所涉及的關鍵酶之一[21]。其催化的底物為C3-R 構型的稀有糖，如D-阿洛酮糖。 它的催化機制為： 將D-阿洛酮糖磷酸化生成D-阿洛酮糖-1-磷酸，同時消耗一分子ATP，生成對應的ADP。由于RhaB 催化的反應為不可逆過程，因此將異構酶DPE 與RhaB 串聯，可以破壞異構化反應的平衡，從而提高D-阿洛酮糖的產率，有利于工業化生產。

多聚磷酸鹽激酶（polyphosphate kinase，PPK）分為2 種：多聚磷酸鹽激酶1（PPK1）和多聚磷酸鹽激酶2 （PPK2）， 其中PPK1 主要負責多聚磷酸鹽（polyphosphate，polyP）的合成以及ATP 的代謝（合成）[22]，參與的酶促反應為：

PPK2 主要負責GTP 的代謝， 大腸桿菌中只有PPK1，不存在PPK2[23]。 由于PPK1 催化的反應為可逆過程，當ATP / ADP 值偏低時，PPK1 可催化ADP轉化為ATP[24]。因此，本文中主要利用大腸桿菌來源的PPK1 參與的ATP 再生過程，以減少反應中ATP的用量和ADP 的積累， 從而降低合成D-阿洛酮糖的成本。

本研究中將重組蛋白RhaB 在大腸桿菌中大量表達，以D-阿洛酮糖為底物，研究RhaB 的酶學性質，并對純酶RhaB 的反應條件進行優化。 同時，將梭狀芽孢桿菌（Clostridium cellulolyticumH10）來源的DPE 和大腸桿菌來源的RhaB 酶偶聯，以D-果糖為底物，優化偶聯體系的反應條件，計算反應的轉化率。 最后，將DPE、RhaB 和PPK（E. coli）三酶偶聯，降低ATP 的用量，合成D-阿洛酮糖。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質粒和菌株 pET-28a 質粒： 購于Novagen公司；pET28a-rhaB、pET28a-ppk： 作者所在實驗室構建；大腸桿菌MG1655 和Rosetta （DE3）：作者所在實驗室保存；pET28a-dpe： 作者所在實驗室前期構建的質粒。

1.1.2 酶、 試劑及耗材 限制性內切酶和DNA 連接酶：購于TaKaRa 生物公司；腺苷-5′-三磷酸二鈉鹽（ATP）和多聚磷酸鹽（polyphosphate，polyP）：購于上海生工生物公司；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、酸性磷酸酶（acid phosphatase from sweet potato，AP）： 購于Sigma-Aldrich 公司；Ni2+親和層析柱：購于GE 公司；D-果糖：購于阿拉丁有限公司；D-阿洛酮糖：購于TCI（上海）化成工業發展有限公司；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）和Sugar-PakTM色譜分析柱（300 mm×6.5 mm）：購于Waters 公司。

1.1.3 培養基及其他溶液配制 TB 培養基： 酵母抽提物（24 g/L），胰蛋白胨（12 g/L），K2HPO4·3H2O（16.4 g/L），KH2PO4（2.31 g/L），甘油體積分數0.4%。LB 固體培養基：胰蛋白胨（10 g/L），酵母抽提物（5 g/L），NaCl （10 g/L），瓊脂粉（20 g/L）；濕熱滅菌121 ℃，20 min。

蛋白質純化緩沖液：1） 裂解、 平衡緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl（ pH 8.0），150 mmol/L NaCl；洗滌緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），150 mmol/L NaCl，60 mmol/L imidazole；2）洗脫緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），150 mmol/L NaCl，500 mmol/L imidazole；3） 脫鹽緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），50 mmol/L NaCl。

1.2 儀器與設備

PCR 分析儀：Eppendorf 公司產品；Bio-Rad Power/PAC300 電泳儀：美國伯樂公司產品；高效液相色譜儀HPLC：日本日立公司產品；超聲波細胞粉碎機：南京新辰生物科技有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組質粒的構建 采用PrimeSTAR 聚合酶進行PCR 時， 以大腸桿菌BL21 菌液為模板，以rhaB-F：5′-GCGCGGATCCATGACCTTTCGCAATTG TGTC-3′（BamH I）為上游引物，以rhaB-R：5′- GCG CAAGCTTTCATGCGCAAAGCTCCTTTGT -3′ （Hind III）為下游引物來擴增rhaB基因。 采用BamH I 和Hind III 2 種限制性內切酶分別對pET-28a 和rhaB基因進行雙酶切處理，37 ℃靜置3 h。 反應結束后，對酶切產物進行膠回收，并用DNA 連接酶ligationmix 將基因片段和質粒片段進行連接，16 ℃靜置2 h。將連接產物轉入大腸桿菌感受態，冰浴25 min，42 ℃熱激40 s，冰上放置3 min。將轉化產物涂布于帶有卡那霉素抗性的平板進行篩選，挑取轉化子進行菌落PCR 鑒定，并進行質粒提取、酶切驗證和基因測序， 從而得到正確編碼的表達載體pET28arhaB。 pET28a-dpe為作者所在實驗室前期構建的質粒。 pET28a-ppk的構建方法同上。

1.3.2 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導表達 將重組質粒pET28a-rhaB轉入大腸桿菌Rosetta（DE3）中，轉化步驟同上，涂布到LB-Kan 平板上，37 ℃過夜培養，挑取正確的轉化子在5 mL LB-Kan 培養基中37 ℃過夜培養后，取500 μL 培養基，離心收集菌體作為誘導前樣品， 另取2 mL 轉接入200 mL TB-Kan 培 養 基 中，37 ℃搖 床 培 養3 ～4 h，待OD600為0.6～0.8 時，加入IPTG 誘導（終濃度0.1 mmol/L），16 ℃誘導20 h，取500 μL 培養基，離心收集菌體作為誘導后樣品， 另取5 mL 菌體超聲破碎離心， 分別取上清液和沉淀用于SDS-PAGE 檢測。剩余培養基收集菌體，-20 ℃保存待用。

1.3.3 重組蛋白的分離純化及脫鹽 菌體收集后，平衡緩沖液清洗2 遍，用10 mL 平衡緩沖液充分懸浮菌體，超聲破碎，4 ℃下超聲5 s 間歇5 s，超聲時間共為30 min。 結束后12 000g離心30 min，收集上清液，用于蛋白質純化。 破碎上清液中存在大量雜蛋白質，采用Ni2+親和層析柱對其進行純化，可以得到高濃度、純凈的目的蛋白。 蛋白質純化步驟如下：取30 mL 去離子水清洗Ni2+親和層析柱，約6 個柱體積；10 mL 0.1 mol/L NiSO4再生柱子，去離子水洗掉柱子中多余Ni2+；20 mL 平衡緩沖液平衡Ni2+親和層析柱，約4 個柱體積；緩慢上樣，使上清液中蛋白質與Ni2+柱充分結合； 取20 mL 平衡緩沖液再次平衡Ni2+親和層析柱， 洗掉未結合的蛋白質；20 mL洗滌緩沖液平衡Ni2+親和層析柱， 利用低濃度咪唑洗掉與Ni2+柱結合較弱的雜蛋白質；20 mL 洗脫緩沖液平衡Ni2+親和層析柱， 利用高濃度咪唑洗脫并收集與Ni2+柱結合較強的目的蛋白；20 mL 0.1 mol/L EDTA 洗掉Ni2+； 最后20 mL 0.1mol/L NaOH 保存柱子。

由于最后收集到的洗脫液里含有高濃度的咪唑和NaCl，為避免其影響后續反應，需要進行脫鹽處理。 純化后的蛋白質經由超濾管進行濃縮，4 ℃下，4 000g離心30 min，并換用脫鹽緩沖液以降低蛋白質中的鹽濃度。 最后，利用BCA 蛋白質濃度檢測試劑盒精確檢測目的蛋白濃度， 分裝后加入甘油，-80 ℃長期保存。 DPE、PPK 的表達純化步驟與RhaB 一致。

1.3.4 重組蛋白RhaB 活性測定方法 檢測RhaB的活性反應條件 （250 μL 反應體系） 如下： 在50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）緩沖液中，加入D-阿洛酮糖5 g/L，5 mmol/L Mg2+，30 mmol/L ATP，0.2 g/L RhaB，在35 ℃反應30 min 后，用高濃度NaOH 調pH， 終止反應。 15 000g離心10 min， 上清液過0.22 μm 的水膜除去雜質， 通過高效液相色譜（HPLC）檢測是否有產物的產生。 利用色譜柱C18來測定反應液中ATP 和ADP 的含量。 HPLC 工作條件：0.1 mol/L KH2PO4（pH 6.25）作為流動相，流速1 mL/min，柱溫箱溫度25 ℃，用紫外檢測器進行檢測（λ=254 nm）。

1.3.5 DPE 和RhaB 偶聯體系的活性測定方法 檢測DPE 和RhaB 偶聯體系的活性反應條件（250 μL反應體系）如下：在50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）緩沖液中， 加入D-果糖5 g/L，Mg2+5 mmol/L，ATP 30 mmol/L，DPE 0.2 g/L，RhaB 0.4 g/L，在35 ℃反應30 min 后，100 ℃滅活10 min，15 000g離心取上清液， 將pH 值調為5.0 左右， 外加酸性磷酸酶AP（0.8 μL）處理，30 ℃靜置過夜。 反應結束后，將pH值調回7.0 左右，100 ℃加熱10 min， 終止反應。15 000g離心，上清液過0.22 μm 的水膜除去雜質，利用Sugar-PakTM色譜分析柱來檢測產物D-阿洛酮糖的生成量。 HPLC 工作條件： 流動相為500 mg/L EDTA 鈣鹽，其流速為0.5 mL/min，柱溫80 ℃，RI 示差檢測器。

1.3.6 DPE、RhaB 和PPK 偶聯體系的活性測定方法 檢測DPE、RhaB 和PPK 偶聯體系的活性反應條件（250 μL 反應體系）如下：在50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）緩沖液中，加入D-果糖5 g/L，Mg2+5 mmol/L，ATP 6 mmol/L，polyphosphate 6 mmol/L，DPE 0.2 g/L，RhaB 0.4 g/L，PPK 0.4 g/L， 在35 ℃反應1 h 后，后續步驟參照1.3.5。

1.3.7 重組蛋白RhaB 反應條件的優化 溫度和pH 對RhaB 活性的影響均以1.3.4 中所提到的反應體系為基礎，反應時間均為30 min。 相對酶活定義為各組樣品轉化率相對于最高轉化率所占的百分比。為了測定溫度對RhaB 活性的影響，以50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）作為緩沖液，采用不同溫度（10～70 ℃） 測定RhaB 的酶活。 為了測定不同pH 對RhaB 活性的影響，采用3 種不同緩沖液測定酶活，pH 5.0～7.0 為磷酸緩沖液，pH 7.0～9.0 為Tris-HCl緩沖液，pH 9.0～11.0 為Glycine-NaOH 緩沖液。

1.3.8 DPE 和RhaB 偶聯體系的條件優化 為了測定溫度對偶聯體系活性的影響， 反應體系參照1.3.5。采用不同溫度（10～70 ℃）測定酶活，反應時間為30 min。 為了測定不同pH 對偶聯體系活性的影響，采用3 種不同緩沖液測定酶活，pH 5.0～7.0 為磷酸緩沖液，pH 7.0～9.0 為Tris-HCl 緩沖液，pH 9.0～11.0 為Glycine-NaOH 緩沖液。 為了測定金屬離子對偶聯體系活性的影響，選取Mg2+、Ca2+以及Mn2+等8 種離子測定酶活。 為了測定DPE 和RhaB 酶比例對偶聯體系活性的影響， 采用不同的酶質量比（1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1）測定酶活，其他條件不變。

2 結果與討論

2.1 RhaB 和DPE 在大腸桿菌中的表達

根據大腸桿菌來源的rhaB基因的理論堿基序列長度，軟件預測出其蛋白質相對分子質量為5.3×104。SDS-PAGE（見圖1（a））顯示，經IPTG 誘導20 h后， 樣品在5.0×104～7.0×104之間有清晰的目的條帶，相對分子質量在5.3×104左右，與預測大小基本一致。 同時，RhaB 蛋白質大量表達在上清液中，經Ni2+親和層析柱純化后可得到純度較高的目的蛋白。同理，DPE 的相對分子質量大小為3.4×104，與理論值吻合（見圖1（b））。

圖1 SDS-PAGE 檢測RhaB 和DPE 的表達Fig. 1 SDS-PAGE analysis of RhaB and DPE expression

2.2 RhaB 的酶活性分析

RhaB 磷酸化D-阿洛酮糖生成D-阿洛酮糖-1-磷酸，后者是一種比較昂貴的磷酸化單糖，目前在市場上難以獲得，因此本研究中通過檢測另一副產物ADP 的生成來驗證RhaB 酶活性。由圖2 可知，反應初始，體系中僅含有ATP；反應30 min 后，ATP 的峰值降低，ADP 的峰生成， 加入脫磷酸酶AP 后，ATP 和ADP 的峰均消失。 由此說明RhaB 的確催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛酮糖-1-磷酸， 并將ATP轉化成ADP。

圖2 HPLC 檢測RhaB 的活性Fig. 2 Activity of RhaB detected by HPLC

2.3 溫度、pH 對RhaB 活性的影響

研究溫度、pH 對RhaB 活性的影響， 如圖3（a）所示，當溫度為35 ℃時，RhaB 活性最高，且耐受溫度范圍較廣；在10 ℃時，活性仍可達到60%以上，在60 ℃的高溫下仍保有80%左右的酶活；但當溫度高于70 ℃時，酶活逐漸喪失。 根據報道，來自海棲熱袍菌MSB8（Thermotoga maritimaMSB8）的RhaB最適反應pH 值為8.0[25]。 由圖3（b）可知，來自大腸桿菌的RhaB 最適pH 值為8.0，且該酶在弱酸或弱堿下，仍保有50%以上的酶活。

圖3 溫度、pH 對RhaB 活性的影響Fig. 3 Effect of temperature and pH on RhaB activity

圖4 溫度、pH 對DPE 和RhaB 偶聯體系活性的影響Fig. 4 Effect of temperature and pH on the activity of DPE and RhaB

2.4 溫度、pH 對DPE 和RhaB 偶聯體系活性的影響

由2.3 可知，RhaB 酶的最適溫度為35 ℃，而文獻報道DPE 酶的最適溫度為55 ℃，二者相差較大，因此需要確定偶聯體系的最適反應溫度。如圖4（a）所示，偶聯體系在35 ℃時擁有最高酶活，溫度繼續升高后，酶活逐漸下降。 另外，RhaB 和DPE 對外界溫度的變化均有較強的適應性， 在10～70 ℃范圍內，酶活可以保持在51%以上。 由圖4（b）可知，當pH 值為8.5 時，整個體系的酶活性最高；當pH 偏酸性時，酶活性迅速降低，僅有10%；當外界環境偏堿性時，酶活趨勢稍有下降，但仍保持在50%以上。 因此，該反應更適合于在堿性環境下進行。

2.5 金屬離子、酶質量比對DPE 和RhaB 偶聯體系活性的影響

由文獻報道可知，DPE 是Co2+依賴型酶，而RhaB 是一種激酶， 因此需要研究金屬離子對偶聯體系酶活的影響。 如圖5（a）所示，Co2+存在條件下，反應的轉化率最高，其次是Mg2+和Mn2+；相比于不加金屬離子，多數離子顯著提高了酶活，但Cu2+卻使酶活降低。考慮到Co2+屬于工業重金屬離子，本實驗選擇Mg2+加入反應體系中。 如圖5（b）所示，當DPE和RhaB 的質量比為1∶2 時，該體系的轉化率最高，可達70%；隨著DPE 所占比例的提高，反應的轉化率逐漸降低。 因此，RhaB 的酶質量應為DPE 的2 倍。

圖5 各種金屬離子、酶質量比對DPE 和RhaB 偶聯體系活性的影響Fig. 5 Effect of various metal ions and enzyme ratios on the activity of DPE and RhaB

2.6 DPE 和RhaB 偶聯體系的活性

本實驗在上述最適條件下，以D-果糖為底物，在DPE 和RhaB 共同催化下合成D-阿洛酮糖-1-磷酸，外加酸性磷酸酶AP 處理后，可得到產物D-阿洛酮糖， 利用Sugar-PakTM色譜分析柱檢測D-阿洛酮糖的生成，如圖6 所示，D-果糖和D-阿洛酮糖的出峰時間分別為11.6 min 和16.1 min。 根據HPLC 結果計算可得： 偶聯體系的反應轉化率約為70%，該體系顯著提高了D-阿洛酮糖的得率。

2.7 PPK 在大腸桿菌中的表達

根據大腸桿菌來源的ppk基因的理論堿基序列長度， 軟件預測出其蛋白質相對分子質量為8.0×104。 SDS-PAGE（見圖7）顯示，相對分子質量在8.0×104左右，與預測大小基本一致。同時，PPK 蛋白質大量表達在上清液中，純化后所得目的蛋白質較少，再對蛋白質進行濃縮除鹽，結果發現PPK 的蛋白質質量明顯增多，但同時含有一定量的雜蛋白質。

圖7 SDS-PAGE 檢測PPK 的表達Fig. 7 SDS-PAGE analysis of PPK expression

2.8 DPE、RhaB 和PPK 偶聯體系的活性

本實驗在上述反應條件的基礎上， 以D-果糖為底物， 同時將ATP 用量降低至原來的1/5，在DPE、RhaB 和PPK 共同催化下合成D-阿洛酮糖-1-磷酸，外加酸性磷酸酶AP 處理后，可得到產物D-阿洛酮糖， 利用Sugar-PakTM色譜分析柱檢測D-阿洛酮糖的生成，如圖8 所示，其中，圖8（a）對照組為DPE 和RhaB 雙酶混合， 圖8 （b） 實驗組為DPE、RhaB 和PPK 三酶混合。 根據HPLC 結果計算可得，在降低ATP 用量的條件下，雙酶體系的轉化率僅有27%，而三酶偶聯體系的反應轉化率可達到50%，因此，該體系顯著提高了D-阿洛酮糖的得率。

圖8 HPLC 分析DPE、RhaB 和PPK 偶聯體系的活性Fig. 8 Activity of DPE，RhaB and PPK detected by HPLC

3 結 語

D-阿洛酮糖是一種功能性稀有糖，具有多種生理活性， 市場價格較高。 其合成方法主要為利用DPE 催化D-果糖直接轉化為D-阿洛酮糖，但此反應為可逆過程，轉化率較低。 本研究將DPE 催化的異構化反應與RhaB 參與的磷酸化反應串聯， 借助后者的不可逆過程打破前者存在的可逆平衡，促進D-阿洛酮糖的合成，最終偶聯體系的轉化率可達到70%。在上述研究的基礎上，構建DPE、RhaB 和PPK偶聯體系，使得ATP 得以循環利用，同時減少體系中ADP 的積累。 結果表明，ATP 的用量降低至原來的1/5，同時最終產物得率為50%。 相比于雙酶偶聯體系，引入PPK 酶后，ATP 用量明顯減少，反應轉化率有所降低，原因可能是由于PPK 酶的純度影響了產物的合成。 因此，在后期研究中，可考慮換用其他方法對PPK 進行純化，以提高其純度。綜上所述，此法顯著提高了D-阿洛酮糖的產率， 適用于稀有糖的大規模合成。 同時，建立的DPE、RhaB 和PPK 三酶偶聯體系可應用于全細胞體系中，從而簡化整個生產流程，具有實際應用意義。