瑪咖復合黃精和桔梗調節糖脂代謝作用的研究

李愛民， 馮秋琪，柳 嘉， 吳曉磊， 林 靜， 丁方莉， 夏 凱，苑 鵬， 桑若杰， 萬 寧， 段盛林， 高曉冬

（1. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3. 新時代健康產業（集團）有限公司，北京102206；4. 功能主食創制與慢病營養干預北京市重點實驗室，北京100015；5. 中國食品發酵工業研究院有限公司，北京100015）

經濟發展使人們的飲食結構發生了巨變，以往的粗糧、粗加工、低脂低糖食品逐漸被精細加工的高糖高脂食品所替代。 長期攝入高脂高糖食品會直接導致肥胖，同時伴隨一系列代謝綜合征，如高血糖、高血脂、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和氧化應激等，嚴重時可發展為一系列代謝疾病，如糖尿病（diabetes mellitus，DM）、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 和心腦血管疾病等[1-2]。 其中氧化應激和IR 是上述多種代謝疾病共同癥狀，是研究代謝疾病的關鍵所在。

近年來， 人們對藥食同源的天然資源進行研究， 發現一些植物中的活性成分可通過其抗氧化、清除自由基以及緩解炎癥的作用，來改善糖脂代謝[3-5]。 瑪咖（Lepidium meyeniiWalp）為十字花科獨行菜屬一年或兩年生草本植物，原產于秘魯，是當地的一種保健食品。 2002 年中國引種瑪咖，目前已在云南麗江和新疆等地種植。 瑪咖作為新食品資源，在市場上已經有各種類型的產品，其功效有抗疲勞、調節神經、改善性功能、緩解更年期綜合征等[6]。 黃精為百合科黃精屬多年生草本植物的干燥根狀莖，在我國各省均有廣泛分布，是一種傳統滋補中藥，味甘，性平，歸脾、肺、腎經，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎的功效。 黃精的主要活性成分有黃精多糖、皂苷、黃酮和揮發油等，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化以及降血糖等功效[7]。 桔梗為桔梗目桔梗科多年生草本植物， 是我國藥食同源的傳統中藥，有祛痰止咳、消炎和提高免疫力的作用。 桔梗中主要的藥理活性成分是皂苷類， 此外還含有黃酮、酚類、多糖、甾體等一些活性成分[8]。 研究結果還表明，瑪咖、黃精和桔梗的水提物均具有一定的抗氧化、調節代謝的功效[9-11]。 黃遠英等[12]通過建立小鼠疲勞模型，發現黃精和瑪咖組成的復方含片可增加小鼠肝糖原的含量，并降低血乳酸水平，具有一定的緩解體力疲勞的作用。 也有相關的專利報道，黃精瑪咖組成的復方食品，可緩解人體疲勞并增強免疫力[13-14]。王瑜玲等[15]公開了一種黃精復合桔梗等藥食同源的植物提取物的配方，具有降血糖的功效，可作為輔助降血糖的食品配方。 作者在以往研究的基礎上，對瑪咖、 黃精和桔梗的活性成分分別進行提取，并采用高糖高脂誘導HepG2 細胞，建立糖脂代謝紊亂的細胞模型， 從多個指標評價瑪咖和黃精-桔梗提取物復配對糖脂代謝的調節作用，探究其作用機制及復方的最佳配比，以期為瑪咖功能組方干預代謝疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑪咖：新時代健康產業（集團）有限公司產品；黃精和桔梗：北京同仁堂有限責任公司產品；HepG2細胞株：中國食品發酵工業研究院提供；Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培養基、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）、 平衡鹽緩沖液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）、DMEM 無糖培養基、 小牛血清： 美國Gibco 公司產品； 油酸（Oleic acid，OA）、棕櫚酸（Palmitic acid，PA）、2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽 （DCFH-DA）、 二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、 噻 唑 蘭 （3-（4，5-dimethylthiazol -2 -yl） -2，5 -diphenylterazolium bromide，MTT）、胰蛋白酶、二甲雙胍：美國Sigma 化學公司產品；無游離脂肪酸（FFA）、牛血清白蛋白（FFA-free bovine serum albumin，BSA）：日本WAKO公司產品；RIPA 細胞裂解液、TG 試劑盒、葡萄糖試劑盒、糖原試劑盒、TC 試劑盒：碧云天生物技術研究所提供；氯仿、正丁醇、碳酸鈉、無水乙醇：均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

高速多功能粉碎機： 德清拜杰有限公司產品；旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠制造；真空冷凍干燥機： 北京松源華興科技發展有限公司產品；CKX41 倒置生物顯微鏡：日本OLympus 公司產品；生物安全柜：中國濟南鑫貝西生物技術有限公司產品；MCO-20AIC CO2細胞培養箱： 松下健康醫療器械公司產品；Spectra Max i3 酶標儀： 美國MD 公司產品；電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司產品；超聲波清洗儀：昆山超聲儀器有限公司產品；pH 計：上海雷磁儀器廠制造；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機： 上海安亭科學儀器廠制造；DK-8D 三溫三控水槽：上海博迅實業有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 瑪咖、黃精和桔梗水提物的制備 取一定量的瑪咖、黃精和桔梗干燥后機械粉碎，過60 目篩。 3個樣品各取40 g， 按照料液比1 g∶20 mL 加入到60 ℃蒸餾水中，攪拌均勻，超聲波（功率250 W）輔助提取30 min， 提取液經過4 000 r/min 離心15 min，取上清液，將沉淀再次加入等量蒸餾水超聲輔助提取一次，再次離心15 min，合并上清液后，利用旋轉蒸發濃縮至每個樣品體積為200 mL； 加入氯仿-正丁醇（3∶1，體積比）溶液，使樣品液與有機相溶液體積比為1∶3～1∶4， 振搖30 min 后，3 000 r/min 離心5 min，中間層為變性的游離蛋白層，分離兩相，使蛋白質全部去除；水相中再加入其三分之一體積的有機溶液，重復2 次，有機相合并后可加水使得體積比為3∶1～4∶1， 3 000 r/min 離心10 min，上清液與所有水相合并在一起后冷凍干燥，得到3 個樣品的水提物備用[16-18]。

1.3.2 造模液的配制 稱取一定量BSA，溶于無糖無酚紅不完全DMEM 培養基中， 用10 mol/L 的氫氧化鉀調pH 值至10，并超聲至澄清。 稱取一定量的油酸和棕櫚酸，溶于少量含BSA 相應不完全培養基中，使得FFA 溶液中油酸與棕櫚酸的摩爾比例為2∶1， 同 時FFA 與BSA 的 摩 爾 比 例 為6.6∶1，超聲至澄清。將BSA-FFA 復合物溶液pH 值調至7.4，用0.22 μm 過濾器過濾除菌。 然后加入稱取的一定量的葡萄糖和果糖，混合均勻，再次進行過濾除菌，即得到所需造模液，于-20 ℃保存備用，使用前孵育至37 ℃[19-20]。

1.3.3 樣品的配制 MTT 用樣品的配制：將黃精水提物和桔梗水提物按照質量比為1∶1 混合得到黃精-桔梗水提混合物， 稱取一定量的瑪咖水提物和黃精-桔梗水提混合物， 分別溶于無血清的DMEM培養基， 配制成10 mg/mL 的模型組用母液，用0.22 μm 過濾器過濾除菌。 將配制的2 個樣品置于4 ℃冰箱備用。樣品的配制：將黃精水提物和桔梗水提物按照質量比為1∶1 混合， 得到黃精-桔梗水提混合物，稱取一定量的瑪咖水提物和黃精-桔梗水提混合物，分別溶于配制好的造模液中， 配制成10 mg/mL 的母液， 用0.22 μm 過濾器過濾除菌后置于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 MTT 法測定細胞存活率 HepG2 細胞培養于含新生牛血清10%（體積分數）、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL 的DMEM 培養基中（下文簡稱DMEM10）， 于溫度為37 ℃、CO2體積分數為5%以及相對濕度為90%的培養箱中常規培養。 當細胞生長至80%～90%融合時，移除舊培養液，用PBS 溶液潤洗細胞層后用胰蛋白酶消化細胞，在顯微鏡下觀察細胞呈圓形時，吸出胰酶，加入3 mL DMEM10 終止胰蛋白酶消化反應，將細胞用移液槍吹打成細胞懸液[21]。 取96 孔培養板，每孔加100 μL 細胞懸液，HepG2 細胞濃度為1×105個/mL，37 ℃培養24 h 后棄去培養液，用PBS 清洗1 次，每孔加入不同濃度的處理液100 μL，以含質量分數1% BSA 的DMEM培養基孵育細胞為對照。 培養24 h 后除去培養液，加入0.5 mg/mL MTT-DMEM 于37 ℃避光孵育4 h，再加入100 μL DMSO， 震蕩混勻以完全溶解MTT紫色結晶產物。 用酶標儀在490 nm 處測定吸光度值， 并以對照組細胞的細胞存活率為100%計算其余組別的細胞存活率[22]。

1.3.5 細胞葡萄糖攝取能力的測定 各組細胞加樣處理24 h 后，棄去培養液，用PBS 洗1 次，換為葡萄糖濃度為12.5 mmol/L 的DMEM 培養基， 培養12 h 后取5 μL 上清液， 用葡萄糖測定試劑盒測定葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量[20]。

1.3.6 細胞內糖原含量的測定 各組細胞加樣處理24 h 后，小心棄去培養液，用PBS 洗1 次，細胞用RIPA 裂解液裂解， 用糖原試劑盒測定胞內糖原含量。 結果除以蛋白質含量后，換算為與對照組的百分比為最終表示結果。

1.3.7 上清液及細胞內TG、TC 含量的測定 各組細胞加樣處理24 h 后， 取50 μL 待測細胞上清液，用TG 試劑盒測定TG 含量，結果以模型組TG 含量的百分比表示（%）。

各組細胞加樣處理24 h 后， 小心棄去培養液，將板內待測定細胞用PBS 潤洗2 次后， 加入RIPA裂解液。 充分裂解后，用TG 試劑盒和TC 試劑盒測定TG 和TC 的含量， 結果以模型組TG 和TC 含量的百分比表示（%）[19]。

1.3.8 細胞內ROS 水平測定 將處理的細胞用含有25 μmol/L DCFH-DA 的HBSS 在37 ℃條件下培養30 min， 然后用HBSS 清洗2 次后加入100 μL的HBSS。 用酶標儀測定96 孔黑板中熒光物質的發射光，結果以模型組ROS 水平的百分比表示（%）[23]。

1.3.9 統計學處理 實驗數據采用Origin 8.0 統計軟件進行分析，結果以平均值±標準誤差（±SD）表示。 并對實驗結果進行單因素顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 瑪咖、黃精和桔梗水提物的提取率

分別稱取瑪咖、黃精和桔梗各40 g，水提后，得到瑪咖、 黃精和桔梗的水提物的干質量分別為12.12、18.4、16.36 g。 計算可得，瑪咖，黃精以及桔梗水提物均有較高的提取率， 分別為30.3%、46.0%、40.9%。

2.2 瑪咖復合黃精和桔梗對細胞增殖的影響

采用不同質量濃度的瑪咖和黃精-桔梗混合物處理細胞24 h， 由圖1 可知， 瑪咖在質量濃度為1 mg/mL 時， 細胞存活率與對照組相比沒有顯著差異；2 mg/mL 時，細胞存活率與對照組相比顯著降低（P＜0.05）。 因此，在后續實驗中，瑪咖的上樣質量濃度不得超過1 mg/mL。 同理，黃精-桔梗混合物的后續最大上樣質量濃度也應為1 mg/mL。 瑪咖和黃精-桔梗混合物以體積比1∶1 復配后，質量濃度為0～2 mg/mL 時， 細胞存活率與對照組相比無顯著差異，而當質量濃度大于2 mg/mL 時，細胞存活率顯著下降。 因此得出，2 mg/mL 應為瑪咖和黃精-桔梗混合物以體積比1∶1 復配后上樣的最大質量濃度。

圖1 瑪咖和黃精-桔梗提取物處理24 h 對細胞增殖的影響Fig. 1 Effects of maca and HJJG extract on cell proliferation after 24 h treatment

2.3 瑪咖復合黃精和桔梗對糖脂代謝紊亂細胞糖吸收和胞內糖原含量的影響

由圖2（a）可知，與模型組相比，瑪咖單獨作用時，僅在高劑量質量濃度1 mg/mL 時能夠顯著降低細胞上清液葡萄糖含量（P＜0.05），而黃精-桔梗混合物在中（0.5 mg/mL）、高劑量（1 mg/mL）時均能夠顯著降低細胞上清葡萄糖含量（P＜0.05）。此外，瑪咖和黃精-桔梗混合物不同比例復配后的上清液葡萄糖含量均低于單獨作用時的含量， 當瑪咖和黃精-桔梗混合物以1 mg/mL 質量濃度復配時，上清液葡萄糖含量降低最顯著，下降約30%（P＜0.05）。 從圖中還可看出， 瑪咖和黃精-桔梗混合物高質量濃度復配時， 其促進細胞糖吸收的活性與陽性對照MET相當。 由圖2（b）可知，瑪咖單獨作用時在低、中、高質量濃度時對細胞內糖原水平均無顯著影響，黃精-桔梗混合物僅在高劑量質量濃度1 mg/mL 時能夠顯著提高胞內糖原相對含量（P＜0.05），而復配后的結果顯示， 高質量濃度黃精-桔梗混合物與低、中、高質量濃度瑪咖分別復配時，其細胞內糖原相對含量均高于單獨作用的相對含量；中、高質量濃度的瑪咖與中質量濃度的黃精-桔梗混合物， 高質量濃度的瑪咖與低質量濃度的黃精-桔梗混合物雖在單獨作用時對細胞內糖原無顯著影響，但復配后均能顯著提高細胞內糖原相對含量（P＜0.05），且高質量濃度的瑪咖和高質量濃度的黃精-桔梗復配混合，細胞內糖原相對含量最高。 由以上可以得出，瑪咖和黃精-桔梗混合物復配后能夠顯著促進細胞葡萄糖吸收及胞內糖原轉化，具有調節糖代謝紊亂的作用，且當1 mg/mL 的瑪咖和1 mg/mL 的黃精-桔梗混合物復配時，調節細胞糖代謝紊亂的效果最佳。

圖2 瑪咖和黃精-桔梗混合物對糖脂代謝紊亂細胞上清液葡萄糖和胞內糖原的影響Fig. 2 Effects of maca and HJJG on supernatant glucose and intracellular glycogen with glucose-lipid metabolism disorder

2.4 瑪咖復合黃精和桔梗對糖脂代謝紊亂細胞胞內TG、TC 和上清液TG 的影響

由圖3（a）可知，加樣處理24 h 后，與模型組相比， 瑪咖和黃精-桔梗混合物單獨和復配后的樣品處理細胞，其胞內TG 水平無顯著性差異（P＞0.05）。由圖3（b）可知，瑪咖單獨作用時，在中、高質量濃度均能顯著提高上清液TG 相對含量（P＜0.05），黃精-桔梗混合物在高質量濃度時，能夠顯著提高上清液TG 相對含量（P＜0.05）。 而復配結果顯示，瑪咖和黃精-桔梗混合物在低質量濃度復配時對細胞上清液TG 相對含量無顯著影響，在中、高質量濃度復配時均可顯著提高細胞上清液TG 相對含量（P＜0.05）。胞外TG 含量升高的原因是由于細胞糖吸收增加，促進了TG 的合成以及胞內TG 的排出[22]。由圖3（c）可以看出， 中質量濃度瑪咖復配高質量濃度黃精-桔梗混合物以及高質量濃度瑪咖復配高質量濃度黃精-桔梗混合物均能夠顯著降低細胞內TC 相對含量（P＜0.05），其中高質量濃度瑪咖和高質量濃度黃精-桔梗混合物復配效果最好，細胞內TC 含量下降了約11%。 其可能是通過抑制TC 的合成或促進TC 的分解，實現降低TC 水平[19，23]。 綜上可知，瑪咖和黃精-桔梗混合物復配分別為MH+HJM、MM+HJH、MH+HJH 組合時， 可顯著提高胞外TG 水平，并顯著抑制胞內TC 含量，TC 是引起血脂異常的一個重要指標，因此，瑪咖和黃精-桔梗混合物復配分別為MH+HJM、MM+HJH、MH+HJH 組合時，可顯著調節細胞脂代謝， 其中瑪咖與黃精-桔梗混合物質量濃度分別為1 mg/mL 進行復配時，調節脂代謝的效果最佳。

圖3 瑪咖和黃精-桔梗混合物對糖脂代謝紊亂細胞內TG，TC 和細胞上清液TG 的影響Fig. 3 Effects of maca and HJJG on intracellular TG，TC and supernatant TG with glucolipid-lipid metabolism disorders

2.5 瑪咖復合黃精和桔梗對細胞內ROS 的影響

由圖4 可知，與模型組相比，高質量濃度的瑪咖和中、 高質量濃度的黃精-桔梗混合物在單獨作用時，均可不同程度降低胞內熒光值。 除了低質量濃度的瑪咖和低質量濃度黃精-桔梗混合物復配時對胞內熒光值無顯著影響外，其他復配組合均能夠顯著降低胞內熒光值（P＜0.05）。 當高質量濃度的瑪咖和黃精-桔梗混合物復配時， 胞內熒光值降低最顯著（P＜0.05），約為25%，也即高質量濃度的瑪咖和黃精-桔梗混合物復配時與陽性對照二甲雙胍具有相當的清除ROS 的能力[16]。

由以上結果可知， 瑪咖與黃精-桔梗混合物分別以高質量濃度進行復配時，能夠顯著促進細胞糖吸收和糖原的合成和胞內TG 的合成和排出， 同時降低細胞內TC 含量和ROS 水平。 此外，質量濃度分別為1 mg/mL 的瑪咖與黃精-桔梗混合物復配時調節糖脂代謝的效果最為顯著。

3 結 語

本實驗得到瑪咖水提物的得率為30.3%， 黃精水提物的得率為46.0%， 桔梗水提物的得率為40.9%。 瑪咖和黃精-桔梗混合物分別單獨作用時，對細胞生長無明顯影響的最大作用質量濃度為1 mg/mL（P＞0.05）。 瑪咖和黃精-桔梗混合物體積比1∶1 復配后， 對細胞生長無明顯影響的最大作用質量濃度為2 mg/mL（P＞0.05）。 瑪咖和黃精-桔梗混合物分別以質量濃度1 mg/mL 復配時，能夠顯著促進糖吸收和細胞內糖原的合成， 同時降低細胞內TC含量和ROS 水平。因此，高質量濃度的瑪咖和黃精-桔梗混合物復配可顯著調節HepG2 模型細胞的糖脂代謝紊亂（P＜0.05）。

綜上所述，瑪咖、黃精和桔梗三者復配后能夠更有效地通過促進糖吸收和細胞內糖原合成，降低細胞內膽固醇和ROS 水平，最終達到調節糖脂代謝的效果。 本文中提供了一種安全且無副作用的具有改善糖脂代謝紊亂的瑪咖和黃精-桔梗混合物復方，為瑪咖功能組方的研發提供理論參考，也可為糖尿病等慢性疾病患者飲食提供更多選擇。

圖4 瑪咖和黃精桔梗混合物對糖脂代謝紊亂細胞內ROS 水平的影響Fig. 4 Effects of maca and HJJG on intracellular ROS levels with glucose and lipid metabolism disorders