過度煎炸油誘發大鼠肝臟損傷及其機理研究

張裕涵， 王雨揚， 商文婷， 周中凱

（天津科技大學 食品科學與工程學院，天津300457）

近年來，人們的生活水平逐年提高，飲食結構發生了巨大的改變，煎炸食品由于其獨特的口感和誘人的風味特別受消費者的青睞，與此同時人們對煎炸油的攝入量也急劇的增加[1-2]。 在加熱煎炸油的過程中，由于高溫、水分、空氣（氧氣）的存在，使油脂分子發生許多復雜的氧化、水解、聚合反應。 在這些反應過程中，會產生大量的有害物質，這些有害物質會對人類的健康產生不利的影響[3-4]。 這也是近些年“三高”人群逐漸增多的原因之一。 “三高”指高血壓、高血糖和高血脂，這些慢性疾病也會進一步引發心血管疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化以及代謝綜合征等，嚴重危害人類健康[5-6]。 除此之外，過度攝入煎炸食品， 除了油脂本身品質降低危害健康外，一些焙烤、煎炸食品在加工生產過程中由于食物組分的多樣性、熱不穩定性以及交互反應等也極易產生有毒有害物質，影響機體正常的必需脂肪酸的代謝，這也逐漸引起了人們的重視[7-8]。 因此，探討過度煎炸油在氧化變質，尤其是高溫煎炸一些高淀粉和蛋白質食物后油脂成分的變化對動物機體的毒害作用，具有極其重要的意義。

肝臟是機體新陳代謝的主要器官，也是機體清除內毒素和解毒的重要器官，同時還是一些毒性物質首要攻擊的靶器官，而肝臟主要的解毒方式是增加化合物的水溶性，加速它們的排出[9-10]。 食用油脂在高溫煎炸后會產生大量對機體有害的物質，例如一些多環芳烴以及一些氧化產物等[11-13]，大量攝入煎炸油無疑會大大加重肝臟解毒的負擔，造成毒性物質的積累，損害肝細胞，破壞肝臟正常的生理功能。 作者通過分子生物學手段以健康大鼠為研究模型探討煎炸油對肝臟功能影響的機理，為人們以后的健康飲食提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SPF 級成年Wistar 大鼠24 只（生產許可證編號SCXK-（軍）2012-0004，購自人民解放軍軍事科學醫學院實驗動物中心），體質量290～310 g， 于天津科技大學SPF 級動物實驗研究中心飼養。 飼養條件：溫度20～25 ℃，濕度50%～55%，正常采光；自由攝食進水，飼喂基礎飼料。 動物實驗符合國家《實驗動物管理條例》，并經天津科技大學動物飼養管理中心認可。

1.1.2 實驗儀器與試劑 福臨門一級大豆油：中糧食品營銷有限公司產品。

MK-3 酶標儀：美國Thermo 公司產品；Neofuge 13R 臺式高速冷凍離心機：Heal Force Development Ltd 產品； 梯度PCR 儀：Bio-Rad 公司產品；UV-可見分光光度計：美國Agilent 公司產品；BX51 顯微鏡：OLMPUS 公司產品；數顯恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司產品；超低溫冰箱：美國Thermo公司產品。

血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）試劑盒：南京建成生物制劑有限公司生產；RNA 提取試劑盒、RNA 反轉錄試劑盒、 一步熒光定量RT-PCR試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司產品；PCR 引物：由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及處理 24 只受試動物在適應性喂養1 周后，將其隨機分為3 組：對照組（Con 組）、正常油脂組（NEO 組）、過度煎炸油組（DFEO 組）。各組動物分別以生理鹽水、正常油脂和過度煎炸油灌胃，每組每只大鼠定量1.5 mL/d，各組動物自由進食基礎飼料，共干預6 周。

1.2.2 飼養條件 飼養條件以分籠飼養， 每籠4只，自然晝夜，節律光照。 基礎飼料成分見表1。

表1 動物飼料成分表Table 1 Ingredient list of animal feed

1.2.3 過度煎炸油的制備 為模擬多次煎炸過程中油脂主要成分的變化，研究一些淀粉、蛋白質類食物煎炸后產生的毒性物質對機體的影響， 參照KULIGOWSKI 等[14]制備煎炸油脂的方法并作改進。具體做法為：將原樣大豆油加熱（控制在190 ℃左右）后，間歇性煎炸薯條、雞排、魚丸、雞翅、薯片、饅頭片等，每天煎炸5～6 h，如此重復約1 周，制備過度煎炸油。 處理完畢后，冷卻，防止其在空氣中氧化，密封保存備用。

1.2.4 各種指標的測試方法 相關指標的檢測：大鼠干預6 周后，禁食不禁水12 h 后，將大鼠放入乙醚麻醉盒中直至其角膜反射和痛覺反射消失，腹部主動脈取血，同時取肝臟組織后處死。 全血靜置2～3 h，在高速冷凍離心機中離心（3 500 r/min，4 ℃，15 min）， 用移液器吸取上層血清分裝到eppendorf管中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。 采用試劑盒法測定動物血清中各指標的含量，每組8 個樣品，3 組共計24 個樣品。 指標測試嚴格按照試劑盒說明書要求，每個樣品重測3 次，取平均值。

基因的mRNA 表達量： 采用總RNA 提取試劑盒提取大鼠肝臟組織總RNA，嚴格按照試劑盒說明書操作， 之后將1 μg RNA 反轉錄為cDNA 用于后續的實時定量PCR 測定。 以18S 基因為內參基因，每次從3 個試驗組中取1 個樣本做試驗，每個指標重復測定3 次。 RT-PCR 條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環后，72 ℃10 min 保證完全延伸。處理數據得到mRNA 的相對表達量[15]。選取的內參基因及目的基因的引物序列見表2。

表2 用于擴增mRNA 的實時定量PCR 的引物序列表Table 2 List of primers used to amplify mRNA by quantitative real-time PCR

1.2.5 肝組織病理學觀察及肝臟指數的計算

式中，I為肝臟指數；m1為肝臟質量，g；m0為小鼠體質量，g。

處死大鼠后，速取肝臟并稱質量，計算肝臟指數。于-80 ℃冰箱保存備用。取右前葉肝組織約2 g，用體積分數4%中性甲醛溶液固定， 做石蠟切片，H& E 染色，鏡下觀察肝臟組織病理變化，判斷肝損傷情況。

1.2.6 統計學分析 采用SPSS19.0 統計軟件，試驗結果以±S表示，各組間采用One-way ANOVA 進行統計學分析。

2 結果與討論

2.1 各組大鼠體質量和肝臟指數水平

體質量等各項生理指標相同的大鼠在連續干預6 周后發生明顯變化，其中補充正常食用油干預的老鼠的體質量明顯高于對照組（見表3）?？梢?，過多的攝入正常油脂會使自身脂代謝增加，進而有誘發肥胖的可能。 有報道指出我國人均油脂的攝入量已達到44 g，已超過世界衛生組織規定的30%。 與此相一致的是肥胖和超重的人數也在逐年增加[16]。DFEO 組體質量最低， 煎炸油脂的毒性已影響到機體正常的合成代謝，該組大鼠無法維持正常的生命活動。 周雅琳[17]用煎炸油連續喂養大鼠30 d 后發現，和喂食新鮮油的大鼠相比，雌鼠和雄鼠的體質量都明顯降低。 這個結果與我們的結果也是一致的。 肝臟指數是評價肝臟病變的重要指標，其高、低水平可從側面反映肝臟的機能情況。 由以上數據看出，DFEO 組肝臟指數也發生明顯變化，其肝臟指數2.61 顯著低于對照組的2.91（P＜0.05），推測其原因可能是長時間干預后， 一些毒性物質在肝臟中積累，毒害甚至殺死了部分肝細胞。

表3 大鼠體質量和肝臟指數Table 3 Body weight and liver index in rats

2.2 各組大鼠肝臟相關酶活力的變化

臨床了解肝功能主要是通過檢測血清中ALT、AST、ALP、TBIL 等的水平。 ALT 在肝細胞液中含量較高，AST 在線粒體中含量較高[18]。正常細胞由于細胞膜的包裹，所以ALT 和AST 不會釋入血液中。 肝細胞受到損害后，細胞變性、壞死，細胞膜破碎或細胞膜的通透性增加， 肝細胞中所含的ALT 和AST就會被釋放到血液中， 使血液中ALT、AST 水平增加， 因此ALT 和AST 是檢驗肝損傷靈敏而特異的指標[19-20]。 同時ALP、TBIL、ALB 的含量也是肝功能檢測常用的指標。 檢測血清中的ALT、AST、 ALP、TBIL 和ALB 水平，可反映肝組織受損或病變情況[21]。表4 顯示，在持續干預6 周后，DFEO 組大鼠血清中ALT、AST 水平均比對照組極其顯著升高（P＜0.01）；NEO 組大鼠血清中ALT 水平略有升高。 過度煎炸油已對大鼠肝臟造成嚴重損傷， 肝細胞壞損，ALT、AST 大量流出，同時ALP 水平也顯著升高（P＜0.05）。然而，TBIL 和ALB 在正常油脂和煎炸油干預后無顯著變化。

表4 各組大鼠肝功能指標水平Table 4 Liver function indexes of rats in each group

2.3 各組大鼠肝臟病理學形態變化

在正常生理狀態下，肝臟組織H & E 染色切片圖顯示肝細胞排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞形狀規則，細胞分界清晰，排列致密且均一，無細胞變性和異常，如圖1（a）所示。 圖1（b）顯示灌胃6 周正常油脂后，肝組織切片顯示有輕微變化，出現少量脂肪空泡。 然而，食用煎炸油干預6 周的大鼠則發生明顯的病變，正常組織結構明顯消失，肝細胞索排列紊亂，肝臟正常的放射狀結構遭到破壞，出現大量紅染顆粒，肝竇擴張，該組多只大鼠出現明顯的脂肪大泡、彌漫性炎癥浸潤（見圖1（c）），從組織形態病理學來看，過度煎炸油對肝組織的損傷十分明顯。

圖1 各組大鼠肝組織病理學觀察（H & E，×40）Fig. 1 Pathology of liver in different groups

2.4 不同油脂對大鼠肝臟組織中相關mRNA 表達的影響

谷胱甘肽硫轉移酶（GST）是人體Ⅱ相代謝中至關重要的酶，它能催化谷胱甘肽與內源性和外源性的親電子物質結合。 該酶主要存在于肝臟內，微量存在于腎、小腸、睪丸、卵巢等組織中。 由于肝細胞質內富含GST，當肝細胞損害時，酶迅速釋放入血液，導致血清GST 活性升高。 GST 的亞家族在人體和大鼠中主要為Gsta、Gstp、Gstm[22]。 圖2 中DFEO組Gsta2和Gsta3基因的表達量均明顯下調（P＜0.01），下調幅度接近60%。 可見，過度煎炸油中的毒性物質隨時間的延長在肝臟積累，毒害殺死肝細胞的同時，也在很大程度上影響相關基因的表達，使肝臟解毒能力下降。Gclc和Gclm都是谷氨酸半胱氨酸連接酶，也被稱為γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，是谷胱甘肽合成的第一個限速酶， 其基因Gclc和Gclm在DFEO 組大鼠中也明顯下調。 由此可見，攝入過度煎炸油后， 在很大程度上影響大鼠肝組織中Gsta2、Gsta3、Gclc、Gclm基因的表達量，破壞了肝臟正常的合成和代謝反應，進而影響機體正常的生命活動[23-25]。

圖2 不同試驗組mRNA 的相對表達量Fig. 2 Relative expression of mRNA in different groups

3 結 語

正常油脂在過度煎炸一些常見食物后會產生一些很強的毒性物質，攝入動物體后對肝組織造成很強的損傷， 長期食用會破壞甚至殺死肝細胞，影響肝臟中一些重要基因的表達，嚴重危害肝臟正常的生理機能。 在日常生活中應該少吃甚至遠離煎炸食物，同時控制正常油脂的攝入量，少吃高油脂食物，倡導綠色健康飲食。