高生理活性黑蒜加工工藝優化及功能成分變化

史潤東東， 楊 成， 余佳浩， 張 建， 張連富*，，3

（1. 江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2. 石河子大學 食品學院，新疆 石河子832003；3. 北京工商大學 食品營養與人類健康北京高精尖創新中心，北京100048）

黑蒜是將鮮蒜置于高溫高濕條件下經60～120 d的美拉德反應制得的天然大蒜產品。 口感酸甜軟糯，無蒜辛辣味道，加工中顯著增加的美拉德反應產物、有機硫化物、多酚、黃酮類物質等多種成分的共同作用促使黑蒜的功效顯著強于鮮蒜[1-2]。 其中Amadori 化合物作為美拉德反應初期生成的一類穩定的極性分子，對形成果蔬制品獨特的香氣、味道有重要影響，不僅能夠反映美拉德反應的進程，還具有多種生物活性，比如Ryu 等[3]研究表明黑蒜提取物中的1-脫氧-1-L-精氨酸-D-果糖 （Fru-Arg）具有抗氧化作用。 番茄產品中的1-脫氧-1-L-組氨酸-D-果糖（Fru-His）被證明具有抗腫瘤和抑制血管緊張素轉換酶活性的作用[4]，可作為一類新型的潛在抗氧化劑。 因此Amadori 化合物可作為黑蒜品質的重要表征因子。 Yuan 等[5]研究表明黑蒜中3 種Amadori 化合物和3 種Heyns 化合物的含量比鮮蒜提高40～100 倍。 但反應進行到后期會產生諸如5-HMF、丙烯酰胺等多種有害成分。 除了加工中新生成的有益成分，鮮蒜本身還含有許多內源性生物活性物質如S-烯丙基半胱氨酸衍生物、烯丙基硫化物、硫代亞磺酸酯類等，具有降血壓、提高免疫力、抗癌等健康益處[6]。 其中蒜氨酸作為大蒜特有的成分，是大蒜素的前體，具有較高的穩定性和多種功效，包括抗菌和降血糖等[7]。另外S-烯丙基半胱氨酸（SAC）在黑蒜中的含量可提高5～6 倍，具有降膽固醇、抗糖尿病、神經保護等作用，是黑蒜的有機硫化物中主要的活性成分之一[8]。

目前由于無標準的質量評價體系，市場上的黑蒜質量良莠不齊，且過長的加工時間使生產效率大大降低，成本較高。 在品質評價上，現有研究主要關注黑蒜中還原糖、氨基酸、總酸、多酚、黃酮等營養成分變化[9]。 在縮短加工時間上，多集中在對大蒜預冷凍、短時預熱、超聲預處理等方面[10-11]。 美拉德反應作為影響黑蒜品質及形成速度的關鍵，會受到溫度、水分活度、時間、pH 等多種因素的影響。 研究表明升高黑蒜的加工溫度會加速5-HMF 的產生及褐變[12]。 但各因素對黑蒜中Amadori 化合物的影響仍不明確。 另外目前未見關于水分活度對黑蒜功能成分影響的報道。

通過探究初始水分活度、溫度、時間對黑蒜中12 種Amadori 化合物、SAC、蒜氨酸的影響，確定了黑蒜加工中的關鍵控制點，以期縮短加工時間的同時，最大限度保留有益物質，減少美拉德后期有害物質生成，并與市售黑蒜在上述功能成分、5-HMF、丙烯酰胺、抗氧化能力及感官指標方面進行對比，為黑蒜的加工及評價提供工藝參數和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜：市售（3 種市售黑蒜產地為山東金鄉、江蘇邳州、云南洱海，加工時間均為120 d）；蒜氨酸（純度98%）： 購自上海愛必信生物科技有限公司；SAC（純度98%）、5-羥甲基糠醛（純度99%）、丙烯酰胺（純度98%）：購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸、甲酸（均為分析純）：購自國藥集團化學試劑有限公司；Amadori 化合物：基于作者所在實驗室已有研究基礎自制[13]（其結構經紅外光譜、三重四級桿質譜及核磁共振表征，純度均大于98%）。 用于色譜分離的甲醇和乙腈為HPLC 級。 所有溶液用超純水制備。

1.2 主要儀器與設備

LHS-50CL 型恒溫恒濕箱：上海一恒科技有限公司產品；高效液相色譜儀（紫外檢測器）、超高效液相色譜串聯四級桿質譜聯用儀：美國Waters 公司產品；高速冷凍離心機：湖南湘立科學儀器有限公司產品；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫療器械有限公司產品；CH-8853 水分活度儀： 瑞士Novasina公司產品；電子天平：上海梅特勒-托利多儀器商貿公司產品；SIZ（Ⅲ）循環水式多用真空泵：南京予凱儀器設備有限公司產品；KQ-100E 型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產品；超純水儀：美國密理博公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 初始水分活度 新鮮大蒜去皮，選取無損傷且大小一致的蒜瓣均勻分布在潔凈紗布上，在90 ℃下進行熱風干燥，以降低原料的初始水分活度。 結合預實驗結果，在不同時間點取樣，使原料初始水分活度分別為0.87、0.71、0.54、0.41、0.28，置于鋁箔袋中真空密封，以固定原料水分活度。 將樣品放入恒溫恒濕箱80 ℃反應2 d[14]。測定12 種Amadori 化合物、SAC、蒜氨酸的質量分數，以干質量計，確定最佳初始水分活度。

1.3.2 加工溫度 90 ℃下將原料預烘到初始水分活度0.87，在濕度80%，溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，反應2 d。 測定上述功能成分含量，以干質量計，確定最佳加工溫度。

1.3.3 加工時間 在原料初始水分活度0.87、濕度80%、溫度70 ℃條件下，取樣時間分別為8、10、12、14、16 d，測定上述功能成分含量，以干質量計，確定最佳加工時間。

1.3.4 樣品制備 黑蒜提取液的制備參考Bae 等[15]的方法并作適當修改。準確稱取3 g 樣品，將樣品密封后在80 ℃下水浴15 min 滅酶。 加60 mL 超純水破碎打漿。 混合物超聲（500 W）提取20 min，離心（10 000 r/min，10 min）取上清液。 殘渣洗滌3 次并分別離心取上清液， 將上清液混合定容至100 mL。適當稀釋后過0.22 μm 膜檢測。

1.3.5 蒜氨酸和SAC 的HPLC 分析 蒜氨酸和SAC 的質量分數測定根據Kim 等[16]的方法進行略微改動。 液相條件： 色譜柱X select HSS T3 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長208 nm。 流動相：A 是體積分數0.1%的磷酸水，B 是甲醇。 溶劑梯度如下：0～1 min，98%～95%A；1～3 min，95%～90%A；3～8 min，90%～85%A；8 ～10 min，85%A；10 ～15 min，85%～98%A；15～20 min，98%A。

1.3.6 美拉德產物的HPLC-MS 分析 美拉德產物的質譜條件：數據以多反映檢測掃描（MRM）方式收集；ESI+模式；源模塊溫度120 ℃；去溶劑溫度400 ℃；干燥氣體N2（體積分數＞99.99%）；脫溶劑氣體體積流量600 L/h；毛細管電壓3.0 kV；檢測器電壓1 800 V，掃描范圍m/z100～1 500，目標化合物的液質參數見表1。

表1 美拉德產物的液質參數Table 1 HPLC-MS parameters of Maillard products

色譜條件：檢測采用ACQUITY HSS T3 色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），12 種Amadori 化合物的測定參照余佳浩等[13]的文獻進行輕微調整。柱溫35 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量1.0 μL；流動相：A 是體積分數0.1%的甲酸水，B 是乙腈；溶劑梯度如下：0～1 min，100%A；1～5 min，100%～90%A；5～6 min，90%～50%A；6～7 min，50%～20%A；7～9 min，20%A；9～9.5 min，20%～100%A；9.5～13 min，100%A。丙烯酰胺的檢測參考國標[17]：柱溫30 ℃；體積流量0.2 mL/min；進樣量1.0 μL；流動相：A 是乙腈，B 是體積分數0.1%的甲酸水； 溶劑梯度如下：0～4 min，100%B；4～6 min，100%～85%B；6～8 min，85%～0%B；8～10 min，0%B；10～10.5 min，0%～100%B。 5-HMF的檢測：柱溫35 ℃；體積流量0.2 mL/min；進樣量1 μL；流動相：體積分數0.1%甲酸水∶乙腈=86∶14（體積比）。

1.3.7 水分質量分數測定 按GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》[18]中直接干燥法測定。

1.3.8 水分活度的測定 測定參考GB 5009.238—2016 《食品水分活度的測定》[19]中水分活度儀擴散法，取適量蒜瓣切碎均勻放置在水分活度儀測量池內進行測定，平行3 次。

1.3.9 抗氧化活性的測定

1）DPPH 自由基清除能力的測定[20]：將25 μL黑蒜水提物與200 μL DPPH 溶液 （350 μmol/L）在96 孔板中混合， 室溫避光反應4 h 后于517 nm 處測定吸光值， 按下式計算DPPH 自由基清除率，用甲醇做參比。 實驗重復3 次。

式中，Ai為樣品組吸光值；Aj為空白樣品吸光值；A1為對照組吸光值；A0為空白組吸光值。

2）Fe2+還原能力的測定（FRAP）[21]：將300 mmol/L醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ 溶液和20 mmol/L FeCl3溶液以體積比10∶1∶1 混合得到FRAP 試劑，10 μL 樣品與300 μL FRAP 試劑混合均勻，室溫反應30 min 測定593 nm 處吸光值， 抗壞血酸作陽性對照。以抗壞血酸當量和A593做標準曲線，計算黑蒜水提物的Fe2+還原能力， 結果以抗壞血酸當量（AAE）表示，單位：μmol/g。 實驗重復3 次。

1.3.10 感官評定 參閱文獻[22]制定黑蒜感官評分標準，選取10 名專業人士從口感、外觀、組織狀態、氣味評分，評定前進行多次黑蒜品質特性描述的認定及培訓，測定結果以平均值計，評價標準見表2。

表2 黑蒜感官評定標準Table 2 Standards of sensory quality of black garlic

1.3.11 統計分析 實驗平行3 次，結果以平均值±S 表示， 數據采用One-way ANOVA 進行顯著性分析，當P＜0.05 認為差異顯著。 使用Graph Pad 5.0、Origin Pro 6 軟件進行數據處理。

2 結果與討論

2.1 熱風干燥中功能成分質量分數隨水分活度的變化

圖1 分別顯示了大蒜在熱風干燥過程中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸隨水分活度的變化情況。隨著水分活度的降低，蒜氨酸從質量分數54.81 mg/g 降低到0.95 mg/g，SAC 質量分數輕微增加，Amadori 化合物質量分數在水分活度0.87 到0.54時從282.44 μg/g 顯著上升到583.13 μg/g（P＜0.05），之后則下降。 結果表明，水分活度的適當降低可能更有利于大蒜中Amadori 化合物的生成。 因此作者進一步探究了黑蒜加工中水分活度對上述功能成分的影響。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 黑蒜初始水分活度對功能成分的影響 水分活度作為影響美拉德反應速率的一個重要因素，過高或過低時均不利于反應發生。 另一方面，水分活度的高低與黑蒜的軟硬質地密切相關。由圖2（a）可知， 總Amadori 化合物的質量分數隨初始水分活度的降低呈現先上升后下降的變化，當黑蒜初始水分活度為0.71 時，總Amadori 化合物的質量分數達到最大值 （1 348.67 μg/g）。 除了Fru-Met、Fru-Thr隨水分活度的降低而降低， 其余Amadori 化合物與總Amadori 化合物質量分數的變化趨勢一致。 這可能是由于葡萄糖與氨基酸通過羰氨縮合脫去一分子水，經Amadori 重排生成美拉德反應初期產物時，是一個可逆的反應[23]。當大蒜的水分活度過高時，反應向逆方向進行， 但當大蒜的水分活度過低時，由于缺少水作為傳遞介質， 底物的可移動性降低，接觸幾率減小，造成美拉德反應速度緩慢。 通過熱風干燥將大蒜的初始水分活度迅速降低到合適范圍，利于促使美拉德反應發生， 縮短黑蒜的加工時間。從圖2（b）（c）可知，隨著水分活度的降低，SAC 的質量分數穩中有降，由8.58 mg/g 降到5.91 mg/g，質量分數發生下降可能由于SAC 在更長時間的受熱下參與了美拉德反應。 蒜氨酸在水分活度0.87～0.71時急劇降低，之后趨于平緩。Amadori 化合物在初始水分活度0.71 時達到最大，但當水分活度0.87 時，3 類功能成分總質量分數最高，綜合考慮，確定初始水分活度0.87 為適宜加工條件。

圖1 熱風干燥時蒜中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸質量分數隨水分活度的變化Fig. 1 Contentsof Amadori compounds，SAC and alliin in garlic changed with water activity during hot-air drying

圖2 水分活度對黑蒜中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸質量分數的影響Fig. 2 Effect of water activity on the content of Amadori compounds，SAC and alliin in black garlic

2.2.2 溫度對功能成分的影響 由圖3（a）可知，溫度從40 ℃升到70 ℃時，總Amadori 化合物的質量分數緩慢增加，12 種Amadori 化合物的質量分數表現出不同程度的上升。當溫度80 ℃時，總Amadori 化合物質量分數顯著上升，且12 種Amadori 化合物質量分數均達到最大值。 這可能因為溫度的升高使黑蒜中葡萄糖與氨基酸的反應活性得到增強；另外分子的運動加快，使反應底物接觸的速度提升。由圖3（b）可知，隨著溫度的升高，SAC 的質量分數逐漸由4.72 mg/g 增加到6.92 mg/g，而蒜氨酸的質量分數呈現遞減的趨勢，由21.38 mg/g 減少到2.21 mg/g（見圖3（c））。 由于大蒜預先經過90 ℃的熱風干燥，內部各種酶基本失活，因此通過酶促反應造成蒜氨酸減少的可能性很低， 其損失更可能歸因于熱降解。蒜氨酸中的亞砜鍵具有不穩定性， 當進行熱處理時，蒜氨酸可以轉化為SAC、烯丙基丙氨酸硫化物及二嘌呤硫化物等[24]。 而蒜氨酸的熱降解或谷氨酰半胱氨酸的分解代謝則可能是SAC 質量分數增多的原因。80 ℃下Amadori 化合物和SAC 質量分數最高，但由于美拉德反應速率過快，最終的黑蒜有明顯苦味，品質不佳，故選擇70 ℃作為加工溫度。

圖3 溫度對黑蒜中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸質量分數的影響Fig. 3 Effect of temperature on the content of Amadori compounds，SAC and alliin in black garlic

2.2.3 時間對功能成分的影響 圖4（a）表明隨著加工時間的延長， 總Amadori 化合物的質量分數先升高后降低，在第14 天達到最大值5 510.55 μg/g，其中Fru-Arg 為主要的美拉德產物， 占比高達76%。 總質量分數相比第8 天的2 682.82 μg/g 增加了105%，第16 天則減少到3 845.84 μg/g。 美拉德反應是一個動態平衡的過程，反應前期羰基化合物（主要為還原糖）和氨基化合物（氨基酸和蛋白質）較為充足，Amadori 化合物的生成速率大于分解速率，因此作為反應產物不斷積累；后面Amadori 化合物作為反應底物參與美拉德后期反應，加之還原糖和氨基酸的消耗， 使其生成速率小于分解速率，造成含量下降。 SAC 隨時間的變化如圖4（b）所示，從8～16 d 其質量分數由5.10 mg/g 降到2.35 mg/g，質量分數降低了54%。 蒜氨酸的質量分數在8～10 d從2.73 mg/g 略微下降到2.11 mg/g， 之后則基本穩定在2.0 mg/g（見圖4（c））。事實上，蒜氨酸質量分數的顯著降低主要發生在最初的2 d，Zhang 等[25]發現黑蒜加工過程中蒜氨酸的質量分數在最初的2 d 從11.28 g/kg 減少到3.87 g/kg，4～7 d 質量分數穩定在1.3 g/kg。 蒜氨酸和SAC 質量分數降低可能與其參與美拉德反應有關[26]，研究證明蒜氨酸和葡萄糖間可以發生美拉德反應，主要的反應產物是吡嗪和噻唑[27]。 Wakamatsu 等[28]將SAC 和葡萄糖在低水分、100 ℃條件下加熱，并分離鑒定出9 種美拉德反應產物。 14 d 時功能成分總質量分數及Amadori 化合物質量分數均最高，且黑蒜具備酸甜口感，與12 d和16 d 感官品質相似，故最終選擇加工時間為14 d。

圖4 時間對黑蒜中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸質量分數的影響Fig. 4 Effect of time on the content of Amadori compounds，SAC and alliin in black garlic

2.3 自制黑蒜與市售黑蒜成分對比

為探究自制黑蒜與市售品間的差異，圖5 對比了自制黑蒜與3 種市售黑蒜中上述功能成分及2種美拉德后期有害產物（5-HMF、丙烯酰胺）的含量。 自制黑蒜中的Amadori 化合物和SAC 的質量分數均明顯高于其他3 種市售黑蒜。 3 種市售黑蒜的Amadori 化合物質量分數相近，分別為山東金鄉4 581.44 μg/g、江蘇邳州3 656.78 μg/g、云南洱海3 893.99 μg/g。 而SAC 質量分數差異較大，分別為自制黑蒜2 946.52 μg/g、 江蘇邳州1 222.64 μg/g、云南洱海409.47 μg/g， 山東金鄉黑蒜中未檢測到SAC。另外自制黑蒜的5-HMF 和丙烯酰胺的質量分數低于其他黑蒜產品。 盡管自制黑蒜中的蒜氨酸質量分數（1 879.94 μg/g）低于山東金鄉和江蘇邳州的黑蒜（分別為4 773.36、3 850.60 μg/g），但高于云南洱海的黑蒜（1 418.22 μg/g）。整體來看，自制黑蒜的功能成分總質量分數高于3 種市售黑蒜，美拉德有害產物總質量分數低于3 種市售黑蒜。 這可能是由于市售黑蒜加工時間較長，導致美拉德后期反應的程度較高。 于蒙娜等[29]監測到黑蒜反應20 d 期間5-HMF 一直呈增加趨勢，0～8 d 5-HMF 質量分數幾乎為0，10～20 d 其質量分數由2 kg/g 增長到8 kg/g。而趙雪晴等[11]結合預冷凍處理使黑蒜周期縮短4 d，5-HMF 含量顯著減少。表明長時間的加工會導致后期有害物增多，也標志著美拉德反應程度的加深。 因此縮短加工時間利于減少美拉德后期有害物的積累。

圖5 不同黑蒜中成分對比Fig.5 Comparison of componentsin different black garlics

2.4 抗氧化活性對比

由圖6 可知自制黑蒜的DPPH 自由基清除率（86.82%）略高于山東金鄉的黑蒜（83.17%），兩者比江蘇邳州和云南洱海的黑蒜高約1.3 倍； 自制黑蒜的Fe2+還原能力最強，為109.75 μmol/g，比江蘇邳州和云南洱海的黑蒜（分別為66.83、54.37 μmol/g）高1.6 和2 倍，略高于山東金鄉的黑蒜（101.38 μmol/g），這可能是由于自制黑蒜中較高的Amadori 化合物和SAC 促進了抗氧化能力的提高。

2.5 感官評價

4 種黑蒜的感官評價結果見表3， 云南洱海生產的黑蒜評分最好，其次是自制黑蒜，再次是山東金鄉和江蘇邳州產的黑蒜，各產品間評分差異不顯著。 從評分來看，自制黑蒜在感官品質上與市售黑蒜相近。

圖6 不同黑蒜產品的DPPH 和FRAP 抗氧化活性Fig. 6 Antioxidant activities of DPPH and FRAP in different black garlic products

表3 4 種黑蒜的感官評價Table 3 Sensory evaluation of 4 kinds of black garlic

3 結 語

以黑蒜中12 種Amadori 化合物、SAC 和蒜氨酸為指標，從調控美拉德反應角度出發，探究初始水分活度、溫度、時間對黑蒜功能成分及品質的影響，確定了最優工藝：初始水分活度0.87、加工溫度70 ℃、加工時間14 d。在此工藝下，自制黑蒜中上述功能成分總質量分數最高， 為10 337.01 μg/g，5-HMF 和丙烯酰胺總質量分數最低，為1 326.81 μg/g。DPPH 自由基清除能力和Fe2+還原能力強于3 種市售黑蒜，Amadori 化合物的增多為黑蒜抗氧化性的提升起到促進作用。 本工藝研制的自制黑蒜的感官評分與市售黑蒜相當， 加工時間顯著縮短88%，對于提升黑蒜品質及生產效率具有指導意義。