重組短小芽孢桿菌CotA 漆酶的酶學性質及發酵優化研究

許開忠， 王雅靜， 馬 慧， 蔡宇杰， 廖祥儒， 管政兵*

（1. 江南大學 生物工程學院， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122）

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種多銅氧化酶，因其能夠催化多種酚類、芳香族有機物氧化，并且以氧原子為最終電子受體，最終生成水，并且沒有其他有害的副產物生成[1]，被稱為一種綠色、環保、環境友好的生物催化劑。 漆酶在印染廢水的處理、藥物合成、食品能源等領域具有廣泛的應用前景。 其中細菌漆酶又因其具有更寬廣的底物范圍和熱穩定性，能夠耐受堿性環境等特點，可以適用于工業染料廢水的處理。

目前已有報道表明，許多細菌漆酶被篩選出來并克隆表達， 如2015 年Liu 等從嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus） 中克隆了漆酶基因LacTT，再應用于工業染料剛果紅和活性黑的脫色降解[2]。2018 年，Gaur 和Nisha 等分離并克隆了新型肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）漆酶lac用于從大米和小麥麩生物質生產乙醇[3]。 作者以所在實驗室從五倍子原蜜中篩選出的短小芽孢桿菌W3（Bacillus pumilusW3） 中分離的CotA 漆酶基因（GenBank：AGO57931.1）為出發點，通過分子克隆的手段，將其克隆到具有信號肽的pet-22b 質粒上， 并在大腸桿菌中得到了表達。 在適宜的發酵環境下，重組CotA漆酶的表達量為1 915.3 U/L。 想要提高CotA 漆酶的表達量，優化發酵培養基無疑是最直接有效的方法。

傳統的微生物培養基優化方法主要用正交設計、響應面等方法。 然后微生物發酵是一個多因素影響、非線性的黑箱系統，如果用傳統的優化方法不僅工作量大而且難以準確地預測。 而BP 神經網絡模型（Back propagation neural network）是一種按照誤差逆向傳播來達到訓練效果的多層前饋神經網絡[4]。 使用神經網絡建模無須事先知道輸入與輸出之間的數學關系，而且通過自身的訓練，學習某種規則來達到最接近期望輸出值的結果。 其核心思想是利用梯度下降的搜索方法來達到網絡實際輸出和期望的誤差均方差最小。 因此BP 神經網絡在擬合非線性關系上具有良好的適應性，適合于多變量多因素的過程建模。 該建模方式已經被廣泛地應用到生物發酵領域。

螢火蟲算法（Firefly algorithm）是一種來源于螢火蟲的閃爍行為的仿生群智能優化算法[5]。 該算法模擬螢火蟲在空間移動時，發光弱的螢火蟲會被發光強的螢火蟲吸引的這一特點建立的數學模型。 在搜索過程中，所有螢火蟲互相吸引，吸引能力只跟發光強度和距離相關， 當亮度一樣時則做隨機運動，最終發光最亮的螢火蟲就是函數的最優解。

本研究中首次組合運用BP 神經網絡和螢火蟲算法對重組大腸桿菌發酵產CotA 漆酶培養基進行優化， 運用16 組實驗數據作為樣本數據進行神經網絡的訓練和擬合，完成優化任務。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒載體

短小芽孢桿菌W3：作者所在實驗室保存；克隆和表達載體pET-22b：購自TaKaRa（大連）公司；大腸桿菌JM109 和BL21（DE3）：購自TransGen（北京）公司。

1.2 主要試劑和儀器

高保真酶PrimeSTAR、限制性內切酶、氨芐青霉 素（Amp）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）：購自TaKaRa（大連）公司；2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）：購自Sigma-Aldrich （中國上海）公司；本實驗中所用的化學試劑全部為分析純。

梯度PCR 儀： 杭州博日科技有限公司產品；凝膠核酸電泳儀：北京六一儀器廠制造；高速冷凍離心機： 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司產品；恒溫水浴鍋：常州中誠儀器制造有限公司產品；組合式搖床： 太倉市強樂實驗設備有限公司產品；UV-6000 紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司產品；全自動蛋白電泳儀：生工生物工程（上海）股份有限公司產品。

1.3 培養基

LB 液體培養基：蛋白胨1 g/dL，酵母粉0.5 g/dL，NaCl 1 g/dL；pH 7.0。 固體培養基添加2～3 g/dL 的瓊脂。

發酵培養基：蛋白胨0.6～1.2 g/dL，酵母粉0.3～0.6 g/dL，NaCl 0.6～1.2 g/dL，CuSO40.15～0.30 mmol/L，甘油0.6%～1.2%（體積分數）。

所有培養基都經過1×105Pa 滅菌30 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 CotA 漆酶基因的克隆表達 根據W3 全基因組信息設計引物，上游引物為：5′-CCGGAATTCG ATGAACCTAGAAAAATTTG-3′， 下游引物為：5′-CCCAAGCTTGTACTGGATGATATCCATCGGCC-3′，酶切位點用下劃線表示（EcoRⅠ和HindⅢ）。 提取短小芽孢桿菌W3 的全基因組作為模板， 使用高保真酶PrimeSTAR 進行PCR 擴增目的條帶。 PCR 體系：PrimeSTAR 緩沖液10 μL，dNTPs 4 μL， 上游引物1 μL， 下游引物1 μL， 模板1 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，雙蒸無菌水32.5 μL。 擴增條件為：95 ℃預變性10 s；57 ℃退火10 s；72 ℃延伸90 s； 循環20次。 對PCR 產物和質粒進行雙酶切并產物回收，使用T4 連接酶于16 ℃連接4 h， 然后轉化大腸桿菌JM109，挑取陽性克隆進行測序驗證。 對于測序驗證正確的質粒，轉入大腸桿菌BL21 （DE3）進行表達。

1.4.2 重組菌株的誘導表達及蛋白質純化 誘導方法： 接種體積分數1%的新鮮菌液到50 mL 的發酵培養基。 37 ℃、200 r/min 條件下培養到OD600=0.3～0.6。 將IPTG（0.4 mmol/L）加到培養基中，然后在25 ℃、200 r/min 條件下繼續培養8 h 進行粗酶制備。

粗酶制備：4 ℃、5 000g離心15 min 然后收獲菌體。使用pH 7.0 的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗滌菌體。 加入等體積pH 7.0 的滲透壓緩沖液（20 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4，36%（體積分數）蔗糖，2.5 mmol/L EDTA），然后在25 ℃下，充分攪拌20 min。 馬上加入5 倍體積的預冷超純水，引發滲透壓沖擊[6]，平衡后離心收集上清液。

蛋白質純化方法： 使用HisTrap HP 純化CotA漆酶， 采用高濃度咪唑線性洗脫的方法獲得CotA漆酶純化蛋白質。 并用HiTrapTM進行脫鹽處理。 并通過SDS-PAGE 檢驗蛋白質的表達水平[7]。

1.4.3 CotA 漆酶的酶活測定及SDS-PAGE 分析酶活力單位（U）：1 min 內氧化1 μmol ABTS 所需的漆酶量。

酶反應體系： 預先將2.4 mL 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和500 μL 的3 mmol/L 的ABTS 充分混勻，并于50 ℃條件下水浴5 min。 緊接著迅速加入100 μL 稀釋好的CotA 漆酶溶液。 用分光光度計記錄420 nm 波長下的讀數[8]。

漆酶酶活的計算公式如下：

式中，ΔOD為起始和結束時的吸光度差值；V1為反應體系的總體積 （mL）；n為酶液的稀釋倍數；Δt為反應時間（min）；V2為體系中酶液的體積（mL）；ε 為摩爾消光系數（L/（mol·cm））。

1.4.4 酶學性質分析 最適pH：在50 ℃下，將反應體系放置在不同pH（2.0～11.0）的緩沖液中，測定酶活，以最高酶活為100%，比較獲得最適反應pH。

最適溫度：在最適反應pH 條件下，將反應體系分別在不同的溫度（30、40、50、60、70、80、90、100 ℃）條件下測酶活，以最高酶活為100%，得到漆酶的最適反應溫度。

pH 穩定性： 將酶液放置在不同pH 的緩沖液中，4 ℃孵育5 h，以最高酶活為100%，測定其剩余酶活。

熱穩定性測定：在最適反應pH 條件下，將漆酶置于不同的溫度梯度（30～90 ℃）條件下孵育2 h，以最高酶活為100%，測定CotA 漆酶的剩余酶活。

動力學參數的測定：在上述的最適pH 和50 ℃條件下，以ABTS 作為底物檢測漆酶酶活。配置不同濃度的ABTS（濃度為0.02～0.50 mmol/L）研究反應動力學。 動力學參數Km和Kcat利用Michaelis-Menten equation 計算[9]。

1.4.5 BP 神經網絡模型建立及螢火蟲算法尋優以發酵培養基中的蛋白胨、酵母粉、NaCl、CuSO4、甘油這5 個因素作為BP 神經網絡模型的輸入單元，以重組CotA 漆酶的酶活作為輸出單元建立神經網絡。 同時利用螢火蟲算法尋優確定神經網絡的權值。 本實驗中BP 神經網絡的建立及螢火蟲尋優算法使用MATLAB 2014a 軟件進行。

1.4.6 染料脫色應用 使用純化后的漆酶對甲基紅（λmax=410 nm），孔雀石綠（λmax=619 nm），溴百里香酚藍（λmax=420 nm），酸性藍129（λmax=629 nm）進行染料脫色研究。 脫色體系：10 U 的CotA 漆酶，0.5 mL乙酰丁香酮（10 mmol/L），染料1 mL（0.025 mg/mL），3.5 mL 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（100 mmol/L，pH 3.5）。 將脫色體系（以不加酶的體系作為對照）置于50 ℃水浴搖床上脫色5 h，然后計算脫色率。脫色率計算公式如下：

式中，A1為對照組的吸光度值；A2為實驗組的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 CotA 漆酶重組大腸桿菌構建

通過PCR 擴增獲得短小芽孢桿菌W3 的CotA基因，然后通過雙酶切構建重組質粒并轉化大腸桿菌。測序驗證得到重組菌株pET-22b-CotA 構建成功。

2.2 誘導表達及蛋白質純化結果

按照1.3.2 的方法誘導表達CotA 漆酶，經鎳柱純化，脫鹽柱脫鹽和SDS-PAGE 分析，結果如圖1所示，泳道1 為純化后的CotA 漆酶蛋白質，大小約6.5×104，與ExPASy 軟件預測的蛋白質大小一致。

圖1 CotA 漆酶的SDS-PAGE 分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of CotA-laccase

2.3 CotA 漆酶酶學性質分析

經一系列的酶活測定， 重組表達的CotA 漆酶最適pH 值在3.5 左右，能夠耐受pH 6～12 的環境，保持50%以上的酶活（見圖2（a）（b））。 重組表達的CotA 漆酶最適溫度為80 ℃，在80 ℃下孵育2 h 后依然可以檢測到40%的酶活性（見圖2（c）（d））。 以ABTS 作為底物時，經計算得到Km為0.247 mmol/L，Kcat為41.32 s-1， 說明重組表達的CotA 漆酶具有耐高溫和耐堿性環境的特點，具有適合工業染料脫色應用的潛力。

圖2 酶學性質分析Fig. 2 Enzymatic properties of CotA-laccase

2.4 BP 神經網絡的建模

以16 組重組大腸桿菌發酵CotA 漆酶的五因素四水平正交實驗數據結果進行BP 神經網絡建模。 選取12 組數據作為訓練集，選取其余4 組數據作為測試集來檢驗模型。BP 神經網絡的輸入為發酵培養基中的蛋白胨、酵母粉、NaCl、CuSO4和甘油，輸出為重組CotA 漆酶的酶活。 經訓練比較后確定了隱含層神經元個數為3。 確定了神經拓撲結構為5-3-1 的模型，見圖3。

圖3 BP 神經網絡拓撲圖Fig. 3 BP neural network topology

經過12 次迭代后神經網絡模型的最佳驗證性能達到了0.000 403 34 （見圖4）。 決定系數R2為0.973 41，說明該神經網絡模型模擬效果良好，模擬效果見表1、圖5。

圖4 BP 神經網絡最佳驗證性能Fig. 4 Optimal verification performance of BP neural network

表1 BP 神經網絡擬合結果Table 1 Fitting results of BP neural network

圖5 BP 神經網絡擬合結果Fig. 5 Fitting results of BP neural network

2.5 螢火蟲算法尋優

經過螢火蟲算法尋優獲得，重組大腸桿菌發酵產CotA 漆酶培養基中的蛋白胨、 酵母粉、NaCl、CuSO4和甘油分別為1.16 g/dL、0.428 g/dL、1.06 g/dL、0.274 mol/L 和0.931%（體積分數） 時， 預測重組CotA 漆酶的酶活達到了最大（2 830.23 U/L）。

2.6 模擬效果驗證

以BP 神經網絡和螢火蟲算法尋優獲得的最佳培養基組成進行重組大腸桿菌發酵，重復3 次獲得實際發酵生產的重組CotA 漆酶酶活達到了3 088.68 U/L，相比未優化前提高了61.26%。

2.7 染料脫色應用

CotA 漆酶對4 種染料的脫色效果如圖6 所示。CotA 漆酶對4 種染料都具有不同程度的脫色能力，其中對孔雀石綠和酸性藍脫色效果尤其明顯，脫色效果接近90%。

圖6 染料脫色效果Fig. 6 Dye decolorization

2.8 討論

細菌漆酶由于具有良好的熱穩定性和耐受堿性環境的能力而在工業廢水處理和有毒物質的降解中具有良好的應用前景[10]。 S.Basheer 等從芽孢桿菌R5 菌株中篩選到了高熱穩定性的漆酶[11]。 Wang等成功克隆了芽孢桿菌WD23 來源的CotA 漆酶并用于染料的脫色[12]。 M.Kumar 等克隆表達了來自Pandoraeasp. ISTKB 來源的新型嗜熱漆酶[13]。 各種新的細菌漆酶正在不斷地被人們挖掘和利用。 同時，關于漆酶發酵的優化也是當前研究的一個重要內容。 培養基的成分優化是發酵過程優化的第一步也是關鍵的一步。 傳統的培養基優化方法都是通過響應面分析，但是響應面分析采用多元二次回歸方程作為擬合的基礎， 這就意味著如果影響因素在3個以上的話就必須通過其他方法進行降維。 同時，響應面也會帶來巨大的工作量，例如五因素三水平的響應面分析就需要46 組實驗， 而本實驗中只使用了16 組就達到了良好的擬合效果， 說明人工神經網絡在生物建模和非線性擬合方面具有減少工作量的優點。 近年來也有越來越多的人工神經網絡優化發酵的相關報道，如Peng 等通過BP 神經網絡和遺傳算法優化了類胡蘿卜素發酵培養基，使類胡蘿卜素產量提高了95.9%[14]。Ting 等利用BP 神經網絡優化了畢赤酵母發酵培養基高效表達β-葡萄糖苷酶[15]。 王強等通過BP 神經網絡偶聯遺傳算法優化三孢布拉霉發酵培養基，使番茄紅素產量提高了31.6%[16]。

3 結 語

綜上所述，本實驗中通過分子克隆的手段將短小芽孢桿菌CotA 漆酶克隆到了pET-22b 質粒上并構建了重組大腸桿菌， 重組表達的CotA 漆酶相對分子質量大約6.5×104，以ABTS 作為底物測得反應的最適pH 值為3.5，最適溫度為80 ℃。 重組表達的CotA 漆酶在pH 3.5 和50 ℃的條件下對4 種工業染料具有明顯的脫色效果，其中對孔雀石綠和酸性藍129 脫色率達到了90%左右。 在實際的印染工藝中，酸性藍等酸性染料應用的pH 值為4 左右[17]。 而酸性藍染料廢水的處理一般需要花費大量的堿性物質將pH 值調到6 左右[18]。 本實驗中的重組CotA漆酶能夠直接在酸性條件下直接對酸性藍脫色，因此重組CotA 漆酶在酸性染料廢水的處理方面具有應用潛力。 本實驗中利用BP 神經網絡組合螢火蟲算法尋優得到最佳產重組CotA 漆酶的發酵培養基成分為：蛋白胨1.16 g/dL、酵母粉0.428 g/dL、NaCl 1.06 g/dL、CuSO40.274 mol/L 和甘油 （體積分數）0.931%。 優化過的培養基產CotA 漆酶酶活為3 088.68 U/L，相比未優化之前提高了61.26%。本研究中優化后的CotA 漆酶產量明顯高于已報道的重組短小芽孢桿菌LC01 漆酶產量[19]。 與報道的枯草芽孢桿菌漆酶cjp3 的最大酶活仍有差距[20]，但是這只是搖瓶實驗所得產量，仍然具有很大的潛力。 可見利用BP 神經網絡建模結合螢火蟲算法來優化CotA 漆酶發酵培養基是一種可行的手段。