蒼術揮發油殺菌活性評價及抑菌機制

王 喆， 蔣圓婷， 靳羽含， 趙晨宇， 劉艷麗， 梁寒峭*， 馬國需

（1. 北京城市學院 生物醫藥學部， 北京100094；2. 中國醫學科學院北京協和醫學院 藥用植物研究所， 北京100093）

蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea（Thunb.） DC. 或北蒼術Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根莖。 味辛、苦，性溫，入脾、胃、肝經，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目之功[1]。 蒼術作為常用中藥在我國擁有2000 多年的應用歷史， 最早記載于《神農本草經》，被列為上品。 《本草備要》記載其有辟穢之功。 《名醫別錄》中記載運用含有蒼術的復方，來治療皮膚瘙癢，達到止癢效果[2]。 經過現代科學研究證明， 蒼術的主要殺菌活性成分為揮發油，其中包括蒼術素（atractylodin）、茅術醇（hinesol）、蒼術酮（atractylone）、核桉油醇（eudesmol）等[3]。 大量研究表明，蒼術揮發油具有較強的抗菌活性，對大腸埃希氏菌、酵母、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等臨床常見致病菌具有良好的抑制作用，且抑菌效果與揮發油濃度正相關，揮發油中的蒼術素比蒼術酮具有更強的抑菌活性[4]。 本研究中對蒼術揮發油的體外殺菌活性進行實驗，以常見的大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母作為供試菌，從藥物對菌體生長的影響、AKP 的含量變化、胞外大分子物質蛋白質含量的測定等多個方面闡述蒼術揮發油對供試菌的作用機制，從而為拓展中藥蒼術的開發利用提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSA2202S 電子天平：德國Sartorius 公司產品；DNP-9052BS-Ⅲ恒溫培養箱： 上海新苗公司產品；分光光度計：Spectrum 公司產品；ZWYR-2102C 恒溫培養搖床： 上海智城公司產品；SW-CJIF 超凈工作臺：天津市中環實驗電爐有限公司產品；立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅公司產品；麥氏比濁管：廣東環凱微生物科技有限公司產品。

1.2 藥材

蒼術飲片（批號20180403）：產地河南信陽。

1.3 試劑

堿性磷酸酶試劑盒（批號20181228）：南京建成生物工程研究所提供；甘氨酸（批號080702）：上?？颠_氨基酸廠制造； 吐溫-80 （批號2017052）：Biotopped 公司產品；酵母浸粉（批號20130728）：北京奧博星生物技術有限責任公司產品； 胰蛋白胨（批號20181022）：北京奧博星生物技術有限責任公司產品；蛋白胨（批號20170306）：北京奧博星生物技術有限責任公司產品；牛肉膏（批號20150102）：北京奧博星生物技術有限責任公司產品； 葡萄糖（批號20160828）：北京化工廠制造；十二烷基硫酸鈉（檔案編號069709005200）：山東優索化工科技有限公司產品；瓊脂粉、氯化鈉（批號20140623）：北京化工廠制造；磷酸二氫鉀（分析純）：北京化工廠制造；氫氧化鈉（分析純）：北京化工廠制造。

1.4 指示菌和培養基

CICC 21530 大腸埃希氏菌Escherichia coliEHECO157：H7、CICC 21600 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus：胰酪大豆胨瓊脂斜面培養基（TSA）；CICC 32380 白假絲酵母Candida albicans：沙氏瓊脂斜面培養基（SDA）。

2 實驗方法

2.1 蒼術揮發油的制備

研究發現，水蒸氣蒸餾法提取的蒼術揮發油對各供試菌體的抑制作用要強于微波萃取法和索氏提取法[6]。 本實驗結合前期考察的揮發油提取方法，將蒼術飲片粉碎為干粉， 裝入盛有10 倍量水的水蒸氣蒸餾提取器中，溫度控制在100 ℃左右，6 h 后提取器支管中流出的液體變為無色， 隨即停止提取。 用分液漏斗分離去除下部蒸餾水，上部棕黃色液體即為蒼術揮發油粗提物，于4 ℃冰箱中密封保存[5]。

2.2 抑菌活性研究

2.2.1 平板的制備 指示菌平板分上下兩層。 先加入8 mL 瓊脂培養基作為下層培養基， 待培養基完全凝固后，在其上擺放4～6 只牛津杯，再加入20 mL相應培養基。 待上層培養基完全凝固后，將牛津杯取出。

2.2.2 抑菌實驗 用新鮮培養的指示菌株菌懸液，調至菌液濃度0.5 McFarland，均勻涂布在雙層平板上，孔內加入100 μL 的樣品、陰性對照（100 μL 新鮮培養基）和陽性對照（阿莫西林溶液），置于4 ℃冰箱4 h 后，放置在37 ℃的環境中培養24 h（或28 ℃培養48 h），觀測抑菌圈形成情況，使用游標卡尺精密測量抑菌圈的外徑d（cm），以反映抑菌活性強弱。

制備含揮發油提取物的培養基平皿：將揮發油提取物用DMSO 稀釋，每一菌株制備7 個系列質量分數。 將不同質量分數的試液分別定量地加到熱溶解后的相應培養基中，混勻，制成分別含揮發油提取物 （質量分數）0.01%、0.025%、0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、1.0%共7 個不同的平皿。

用新鮮培養的指示菌株將菌懸液濃度調至0.5 McFarland，而后均勻涂布在上述平板上，放置相應溫度下培養24 h， 觀察各平皿的菌落生長情況，確定出揮發油提取物的最小抑菌濃度（MIC）[7-8]。

2.3 懸液定量殺菌實驗

2.3.1 揮發油溶液的配制 分別取蒼術揮發油純品和醇提物與無水乙醇混溶，分別制成含揮發油質量分數25%和2.5%的溶液， 醇提物質量分數10%和1%的溶液，備用。

2.3.2 菌懸液制備 將各實驗菌經過分離培養，選取單個典型菌落， 白假絲酵母接種于SDA 培養基，大腸埃希氏菌、 金黃色葡萄球菌接種于TSA 培養基，培養24 h，用磷酸鹽緩沖液洗下斜面培養物，經充分混勻， 稀釋配制成實驗菌懸液， 含菌量為1×107～5×107CFU/mL[9]。

2.3.3 中和劑的制備及選擇 中和劑的制備：準確量取0.68 g 磷酸二氫鉀、1.415 g 無水磷酸氫二鈉，加水稀釋至1 000 mL，配制成磷酸鹽緩沖液。 準確稱量甘氨酸、吐溫-80，按實驗需要，配制成含0.5 g/dL甘氨酸，3 g/dL 吐溫-80 的磷酸鹽緩沖液[10]。

實驗菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和白假絲酵母，設計6 組實驗，按懸液定量殺菌實驗程序進行中和劑選擇實驗[11-12]。 當第6 組不長菌，第3—5 組組間菌數差不超過10%，第1 組不長菌或菌數遠少于第2 組，第2 組菌數超過100 CFU/mL 時，連續3 次重復實驗結果一致，表明所試中和劑及其濃度適宜。

2.3.4 懸液定量殺菌實驗 實驗在20 ℃條件下進行， 用質量分數3%DMSO 將各蒼術揮發油乙醇溶液溶解，再用無菌蒸餾水稀釋成實驗濃度。 在無菌試管內加入0.5 mL 菌懸液與4 mL 不同濃度的蒼術揮發油溶液以及0.5 mL 硬水混勻，作用至規定時間，吸取0.5 mL 反應液，加入4.5 mL 中和劑，混勻。中和作用10 min，取混合后的樣液1 mL 接種培養，接種于事先準備好的營養培養皿上，放入37 ℃的恒溫培養箱內進行培養，48 h 后對菌落數進行統計[11]。

制劑溶劑對照實驗是將0.5 mL 菌懸液與4 mL稀釋液及0.5 mL 硬水混勻，作用10 min 后，按上述程序進行活菌計數，計算平均殺滅率。

陽性對照實驗是將0.5 mL 菌懸液與4 mL 阿莫西林或氟康唑溶液及0.5 mL 硬水混勻，作用10 min后，按上述程序進行活菌計數，計算平均殺滅率。

2.4 抑菌機制研究

2.4.1 對菌體生長曲線的影響 分別將不同濃度的蒼術揮發油溶液加入菌懸液中，使得揮發油終質量分數分別為0.5%、1.0%、2.0%，菌體濃度為1×107CFU/mL 的NB 培養基，對照組加滅菌雙蒸水，將以上培養基放入恒溫培養箱，37 ℃、120 r/min 的搖床中培養12 h，每隔1 h 取樣，于600 nm 處測定吸光度[13]。

2.4.2 對菌體細胞壁的影響 分別將不同濃度的蒼術揮發油溶液加入菌懸液中，揮發油終質量分數分別為0.5%、1.0%、2.0%， 菌體濃度為1×107CFU/mL 的NB 培養基，對照組加滅菌雙蒸水；將以上培養基置于恒溫培養箱，37 ℃、120 r/min 的搖床中培養，定時于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 取樣，離心10 min，速度4 000 r/min，吸取上清液按照試劑盒方法測定堿性磷酸酶（AKP）的含量變化。 每個樣品平行實驗3 次，取平均值[13-15]。

2.4.3 對菌體可溶性蛋白質泄露量的影響 分別將不同濃度的蒼術揮發油加入菌懸液中，使得揮發油終質量分數分別為0.5%、1.0%、2.0%， 菌體濃度為1×107CFU/mL 的NB 培養基，對照組加滅菌雙蒸水，將以上培養基放入恒溫培養箱，37 ℃、120 r/min 的搖床中培養。 分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 定時取樣，蛋白質含量按照Bradford 的方法進行。 每個樣品平行實驗3 次，取平均值[15-16]。

3 結果與分析

3.1 蒼術揮發油抑菌活性

3.1.1 不同提取溶劑對提取物抑菌效果 實驗結果可知，質量分數為2.5%和25%蒼術蒸餾提取的揮發油具有抑菌效果，隨著質量分數的增加對菌體的抑制作用隨之增加。 蒼術醇提物無抑菌效果，助溶劑無抑菌效果。 陽性對照對細菌有抑制效果，對白假絲酵母無抑菌效果，見表1。

3.1.2 不同質量分數蒼術揮發油抑菌效果 蒼術揮發油提取物對白假絲酵母的抑制活性最強，MIC值為0.5%；對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌抑制活性較弱，MIC 值均為1.0%。 見表2。

3.2 蒼術揮發油殺菌活性

3.2.1 中和劑選擇實驗 實驗結果表明，以含5 g/L甘氨酸、30 g/L 吐溫-80 的磷酸鹽緩沖液組成的中和劑， 可有效中和蒼術揮發油抑菌液殘余抑菌作用，且中和劑及其中和產物對實驗菌和培養基無影響，結果見表3。 中和劑選擇含0.5 g/dL 甘氨酸，3 g/dL 吐溫-80 的磷酸鹽緩沖液符合要求。

3.2.2 懸液定量殺菌實驗 實驗結果表明，蒼術揮發油質量分數為0.5%時對大腸埃希氏菌具有一定抑制效果，對白假絲酵母和金黃色葡萄球菌的抑制質量分數均大于2%。 單方使用抑菌效果有限，由于受到蒼術揮發油溶解性的影響， 當質量分數大于2%時，會產生分層現象，影響產品穩定性和抑菌效果。 結果見表4。

表1 蒼術揮發油的抑菌實驗Table 1 Bacteriostasis experiment of volatile oil of Atractylodes chinensis

表2 揮發油的最小抑菌濃度Table 2 Minimum bacteriostatic concentration of volatile oil

表3 蒼術揮發油中和劑實驗結果Table 3 Experimental results of volatile oil neutralizer in traditional Chinese medicine

表4 蒼術揮發油殺菌效果Table 4 Germicidal effect of volatile oil of Atractylodes chinensis

3.3 蒼術揮發油抑菌機制實驗

3.3.1 蒼術揮發油對菌體生長曲線的影響 由圖1—3 可見，各菌體經過蒼術揮發油處理后生長趨勢與陰性對照組相比變化明顯，且蒼術揮發油質量分數越大對生長曲線的影響也越大。 在12 h 內，陰性對照組菌體數量呈現增加趨勢，中低劑量樣品溶液吸光度雖略有增加， 但總體水平低于陰性對照組，說明菌體的繁殖受到一定程度的抑制；而當蒼術揮發油質量分數增加到2%時，12 h 反應結果與初始質量分數基本保持一致， 始終維持于0 點附近，表明蒼術揮發油對于各菌體均具有抑制作用，抑菌活性強弱與揮發油質量分數呈正相關。

圖1 不同質量分數蒼術揮發油對大腸埃希氏菌生長曲線的影響Fig. 1 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the growth curve of Escherichia coli

圖2 不同質量分數蒼術揮發油對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig. 2 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the growth curve of Staphylococcus aureus

圖3 不同質量分數蒼術揮發油對白假絲酵母生長曲線的影響Fig. 3 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the growth curve of Candida albicans

3.3.2 蒼術揮發油對菌體細胞壁的影響 堿性磷酸酶是存在于細胞膜與細胞壁之間的一種酶，在正常情況下細胞外很難檢測到它的含量。 當細胞膜或細胞壁被破壞后，細胞通透性增加，堿性磷酸酶泄露到細胞外，通過檢測細胞外酶的變化可以反映出細胞結構及通透性的改變。 從圖4—6 中可以看出，從反應最初開始，3 種菌在不同質量分數的蒼術揮發油的作用下堿性磷酸酶水平顯著高于對照組，堿性磷酸酶含量與蒼術精油質量分數成正相關，且一直處于平穩狀況。 通過觀察可以得知，蒼術揮發油對3 種指示菌細胞壁具有很強的破壞性。

圖4 不同質量分數蒼術揮發油對大腸埃希氏菌細胞壁的影響Fig. 4 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on cell wall of Escherichia coli

圖5 不同質量分數蒼術揮發油對金黃色葡萄球菌細胞壁的影響Fig. 5 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on cell wall of Staphylococcus aureus

圖6 不同質量分數蒼術揮發油對白假絲酵母細胞壁的影響Fig. 6 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on cell wall of Candida albicans

3.3.3 蒼術揮發油對菌體胞外蛋白質的影響 標準曲線方程在0～0.1 μg/mL 質量濃度范圍內具有良好的線性關系，x為蛋白質質量濃度，y為吸光度，菌液蛋白質質量濃度的標準曲線方程為y= 7.435 7x+0.022，R2=0.996 4。

由圖7—9 可見， 經不同質量分數的蒼術揮發油處理后，與對照組相比，在600 nm 處的吸光度值明顯增加，且胞外蛋白質的吸光度隨著揮發油質量分數的增大而增大，說明隨著蒼術揮發油質量分數的增高，菌體通透性屏障受損程度隨之增高，從而從胞內流出的蛋白質量越多，蒼術揮發油可通過破壞菌體細胞膜結構，從而發揮抑菌殺菌的效果。

圖7 不同質量分數蒼術揮發油對大腸埃希氏菌胞外可溶性蛋白質泄露量的影響Fig. 7 Effects of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the extracellular soluble protein leakage of Escherichia coli

圖8 不同質量分數蒼術揮發油對金黃色葡萄球菌胞外可溶性蛋白質泄露量的影響Fig. 8 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the extracellular soluble protein leakage of Staphylococcus aureus

圖9 不同質量分數蒼術揮發油對白假絲酵母胞外可溶性蛋白質泄露量的影響Fig. 9 Effects of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the extracellular soluble protein leakage of Candida albicans

4 結 語

本研究中考察了蒼術揮發油對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和白假絲酵母的體外抑菌活性、殺菌活性和抑菌機制。 從抑菌效果可知，蒼術蒸餾提取的揮發油對于3 種指示菌均具有抑菌效果，其中對白假絲酵母的抑制活性最強，最小抑菌質量分數為0.5%，對大腸埃希氏菌和金黃色酵母菌的抑制活性相對較弱，最小抑菌質量分數為1.0%。 通過體外殺菌實驗可知，蒼術揮發油對大腸埃希氏菌表現出明顯殺菌效果， 但蒼術揮發油質量分數增加到2%時，對金黃色葡萄球菌和白假絲酵母雖有一定殺滅作用，但殺菌率仍未達到要求。 通過抑菌機制研究可以看出，蒼術揮發油能夠通過影響和破壞菌體細胞膜、細胞壁結構，改變菌體正常滲透作用，導致菌體內AKP、蛋白質等胞內物質外泄，從而導致菌體死亡，發揮抑菌效果。 蒼術揮發油具有一定抑菌效果，但由于其水溶性有限，高濃度單獨使用容易分層析出，影響使用效果，因此以蒼術揮發油為原料的復配制劑還有待進一步研究。