順鉑耐藥宮頸癌細胞中沉默交配型信息調節因子2同源蛋白1的表達及其對細胞增殖的影響 ▲

夏小艷 葉 楓 彭桂元 周小明

(1 長沙衛生職業學院， 湖南長沙市 410017，電子郵箱：274228692@qq.com; 2 湖南中醫藥大學第一附屬醫院內科， 長沙市 410017)

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，據國際癌癥研究所最新統計資料顯示，2012年全球有52.8萬宮頸癌新發病例，26.6萬死亡病例，其中我國宮頸癌的新發病例和死亡病例約占全世界的1/3[1]。目前，手術切除并輔以放化療是宮頸癌的主要治療方法[2]。但化療可使腫瘤細胞出現耐藥性而導致療效不佳，疾病復發乃至死亡。沉默交配型信息調節因子2同源蛋白 1(silent mating-type informator regulator 2 homolog 1，SIRT1)是Sirtuin家族成員之一，是酵母沉默信號調節因子2在人體中的類似物，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的Ⅲ型去乙酰化酶。SIRT1基因定位于人類染色體10q21.3，基因組序列長度約為33 kb，共有9個外顯子編碼747個氨基酸，翻譯后蛋白質量為81.7 kDa，其參與了體內多種生理功能的調節，還參與腫瘤、糖尿病等疾病以及增齡相關性疾病的發生過程[3-4]。有研究表明，SIRT1在宮頸癌HeLa/MMC耐藥細胞亞系中高表達[5]，但機制尚未完全明確。本研究探討耐順鉑(DDP)宮頸癌細胞中SIRT1表達情況及其對細胞增殖的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源與培養 宮頸癌HeLa和SiHa細胞購自美國模式菌種收集中心。細胞均用含10%小牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)在溫度37℃、濕度95%、5%CO2條件下培養。

1.2 主要試劑、儀器 SIRT1抗體(圣克魯斯生物技術公司，CA，美國，批號：sc-74504)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(Abcam公司，批號：ab2785)。辣根過氧化物酶標記的二抗(Abcam公司，批號：ab6785)。TRIzol 試劑(Invitrogen公司，批號：10033-21)。反轉錄試劑盒(賽默飛世爾科技公司，批號：4374876)，細胞計數檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑(賽默飛世爾科技公司，批號：A13261)，脂質體 2000轉染試劑(賽默飛世爾科技公司，批號：11668019)，Wellscan MK3型酶標儀(芬蘭雷勃公司)，siRNA由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

1.3 細胞分組及干預 將HeLa和SiHa細胞分別分為耐藥組和敏感組。敏感組細胞不做任何處理，而耐藥組在培養過程中逐步增加培養液中順鉑的濃度來誘導SiHa和HeLa細胞產生耐藥性，建立對順鉑耐藥的SiHa和HeLa細胞系，即HeLa/DDP和SiHa/DDP細胞系，其中順鉑濃度從0.5～20 nmol(0.5、1,2、4、8、10、12、14、16、18、20 nmol)逐漸增加，直到細胞增殖穩定，無明顯凋亡。再將穩定增殖的耐藥細胞分為HeLa/DDP-NC組、HeLa/DDP-siRNA組，以及SiHa/DDP-NC組、SiHa/DDP-siRNA組，每組取100 μL密度為1×105個/mL的細胞懸液接種于96孔板上，37℃、5%CO2條件下培養過夜，次日按照轉染試劑盒說明書進行siRNA轉染。siRNA組加入合成序列：TGATGAAGCGCTGTAACTCTT；NC組加入合成序列：ACGTGACACGTTCGGAGAATT。實驗重復3次，設3個副孔。

1.4 免疫印跡試驗法 收集敏感組、穩定增殖的耐藥組以及轉染后的耐藥組細胞(轉染組的細胞轉染4～6 h后收集細胞)，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌后加入適當裂解液，裂解離心提取細胞總蛋白，蛋白定量后用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(上樣量為40量/孔)，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜，用5%低脂奶粉在室溫下封閉2 h，阻斷膜的非特異性斑點。然后用SIRT1抗體(體積比為1 ∶1 000)或GAPDH(體積比為1 ∶500)孵育，室溫下于搖床上平緩搖動2 h。TBS洗滌3次，5 min/次，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶2 000)室溫下孵育1 h，TBS洗滌3次，5 min/次，用增強化學發光試劑顯示信號，于AX-II X射線攝影暗匣進行顯影。根據顯影條帶計算條帶灰度值，進而計算目的蛋白的表達。

1.5 實時定量聚合酶鏈式反應 收集敏感組、穩定增殖的耐藥組及轉染后的耐藥組細胞(轉染組的細胞轉染4～6 h后收集細胞)，用TRIzol法提取細胞總RNA。測定純度及濃度后采用反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，操作按說明書進行。以GAPDH為內參基因，進行實時定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測SIRT1 mRNA相對表達量。20 μL反應體系：Bestar?SYBRGreen qPCRMaster Mix 10μL，PCR上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1μL，ddH2O 8 μL，反應條件：94 ℃ 2 min，94℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。所有引物由上海生工生物有限公司進行設計。GAPDH引物：正向5’- CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3，反向5′-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3′；SIRT1的引物：正向5′-GAGTGGCAAAGGAGCAGA-3′，反向5′-TCTGGCATGTCCCACTATC-3′。用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。其中，△Ct=(目的基因Ct-內參基因Ct)，△△Ct=(待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct)。

1.6 細胞增殖檢測 取HeLa/DDP-NC組、HeLa/DDP-siRNA組細胞，以及SiHa/DDP-NC組、SiHa/DDP-siRNA組細胞，以2×105個細胞/孔接種于6孔板，分別在培養0 h、24 h、48 h及72 h后每孔加入10μL CCK-8試劑，在37℃下孵育3 h后于酶標儀450 nm處讀取吸光度值(A值)。實驗重復3次，設3個副孔。

1.7 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 耐藥組與敏感組細胞SIRT1蛋白及mRNA相對表達水平比較 敏感組SiHa細胞、HeLa細胞的SIRT1蛋白及mRNA相對表達水平均低于耐藥組細胞(均P<0.05)。見表1及圖1。

表1 耐藥組與敏感組SiHa、HeLa細胞SIRT1蛋白及mRNA相對表達水平比較(x±s)

圖1 耐藥組與敏感組SiHa、HeLa細胞SIRT1蛋白表達情況

2.2 抑制SIRT1的表達對順鉑耐藥細胞增殖的影響 SiHa/DDP-NC組和HeLa/DDP-NC組細胞SIRT1蛋白及mRNA相對表達水平分別高于Siha/DDP-siRNA組和HeLa/DDP-siRNA組細胞，提示轉染成功，見表2及圖2。CCK-8結果顯示，SiHa/DDP-NC組和HeLa/DDP-NC組細胞培養后24 h、48 h及72 h的A值分別高于SiHa/DDP-siRNA組和HeLa/DDP-siRNA組細胞(P<0.05)，見表3及表4。

表2 DDP-NC組與DDP-NC組細胞SIRT1蛋白及mRNA相對表達水平比較(x±s)

表3 兩組SiHa細胞增殖情況比較(x±s)

表4 兩組HeLa 細胞增殖情況比較(x±s)

圖2 轉染后兩種細胞SIRT1蛋白表達情況

3 討 論

宮頸癌細胞耐藥性與許多因素有關，有研究表明，多重耐藥基因1、P糖蛋白過量表達以及P53突變等相互影響、共同作用，可導致宮頸癌細胞對抗腫瘤藥物產生耐藥[6]。SIRT1是Sirtuin家族成員之一，其在諸多生理過程中，包括應激反應、細胞新陳代謝、細胞衰老、細胞凋亡及增殖等，發揮重要作用。大多數研究表明，SIRT1在腫瘤形成過程中主要起促癌基因的作用，但在特定組織中也可有抑癌基因的作用，而促癌基因與抑癌基因的平衡極為重要[7-8]。還有研究表明SIRT1與腫瘤耐藥性密切相關，其過表達能增強腫瘤的耐藥性[9]。Shuang等[9]研究發現，在乳腺癌患者中SIRT1的過表達和化療耐藥性密切相關，檢測SIRT1表達水平可以預測患者的預后情況。還有學者發現，SIRT1能上調肝癌患者YAP2蛋白的表達而增強肝癌的耐藥性；而抑制SIRT1的表達能降低腫瘤的耐藥性[10]。如采用微小RNA-494抑制胰腺癌患者的SIRT1和c-Myc的表達，可以降低胰腺癌細胞的耐藥性，并抑制胰腺癌細胞增殖[11]。而有學者研究發現，SIRT1 表達下調能明顯降低HeLa/MMC 細胞對絲裂霉素的耐藥性，其作用可能與P糖蛋白有關[5]。

為進一步研究SIRT1對宮頸癌順鉑耐藥的影響，本研究建立了兩個順鉑耐藥的宮頸癌細胞模型，結果顯示，耐藥組SiHa細胞及HeLa細胞的SIRT1蛋白及mRNA表達水平均高于敏感組(均P<0.05)，提示順鉑耐藥宮頸癌細胞株的SIRT1表達上調；而SiHa/DDP-siRNA組、HeLa/DDP-siRNA組細胞A值分別低于SiHa/DDP-NC組、HeLa/DDP-NC組(均P<0.05)，即抑制SIRT1的表達后，耐藥細胞的增殖明顯受到抑制，這與吳琦等[12]的研究結果相似，提示SIRT1可能在宮頸癌細胞對順鉑耐藥的調控中起到了不可或缺的作用。但順鉑耐藥細胞株SIRT1表達水平升高的機制尚不明確，Chen等[13]研究發現，激活β2-腎上腺素受體信號通路可上調SIRT1表達，從而可能影響p53依賴性化療藥物對宮頸癌細胞產生的毒性。本研究未能通過體內實驗分析抑制SIRT1表達后腫瘤細胞增殖的情況，而SIRT1調控宮頸癌細胞對順鉑耐藥性的途徑也仍需進一步研究。SIRI1能否作為宮頸癌耐藥、預后預測的標志物，逆轉宮頸癌耐藥性的靶點，還有待進一步探索。

綜上所述，順鉑耐藥的HeLa、SiHa細胞中SIRT1表達水平升高，抑制SIRT1表達可以抑制順鉑耐藥的宮頸癌細胞的增殖。SIRTI或可作為宮頸癌化療耐藥患者的分子靶標，SIRTI抑制劑或可成為對順鉑耐藥的宮頸癌患者的新治療方向。