腸球菌屬生物膜表型和基因型相關(guān)性分析

丁 麗， 吳 旸， 李 培， 林東昉

腸球菌屬革蘭陽性菌，廣泛存在于環(huán)境以及人、動物消化道內(nèi)，能夠在高鹽（6.5% NaCl）、堿性（pH 9.6）、40%膽汁培養(yǎng)基、10～45 ℃等環(huán)境下生長，對多種環(huán)境具有高度耐受性，有助于其在不同的宿主內(nèi)定植并在環(huán)境中持久存在。根據(jù)腸球菌利用糖類及其分子生物學特征可將腸球菌分為糞腸球菌、屎腸球菌、鳥腸球菌和堅韌腸球菌等[1]。腸球菌是一種重要的條件致病菌，能夠造成嚴重的腹腔感染、尿路感染以及血流感染等。根據(jù)2018年中國CHINET 細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，腸球菌在革蘭陽性菌引起的醫(yī)院感染中排第二位，僅次于金黃色葡萄球菌[2]。由于腸球菌對頭孢菌素類藥物天然耐藥，對氨基糖苷類藥物敏感性亦不高，治療腸球菌感染的藥物選擇空間小。腸球菌感染的致病機制復(fù)雜，其中毒力因子是主要的機制之一，相關(guān)的毒力因子主要包括腸球菌表面蛋白Esp、明膠酶GelE、絲氨酸激酶SprE、聚集性物質(zhì)asa1及細胞溶素（cytolysin）等[3-6]。另外生物膜作為細菌一種獨特的毒力因子，參與致病過程，在應(yīng)對外界環(huán)境壓力、持續(xù)性感染中都起重要的作用。近年來，在許多腸球菌感染中觀察到生物膜，包括泌尿道感染、傷口感染、胃腸道感染和感染性心瓣膜炎[7-8]。生物膜相關(guān)的腸球菌感染不僅難以根除，而且還作為細菌進一步傳播的源頭和耐藥基因的儲庫。

雖然這些毒力因子在腸球菌致病過程中的重要性顯著，但目前國內(nèi)關(guān)于細菌生物膜形成和調(diào)控機制的研究仍然較少。本文報道了臨床無菌體液分離腸球菌生物膜形成能力及其毒力基因攜帶率，分析生物膜的形成能力與毒力基因間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院2015－2017年臨床分離腸球菌，標本來源于血、膽汁和腹水等，已剔除同一患者相同來源重復(fù)標本。OG1RF（生物膜陽性菌株）作為生物膜形成能力陽性對照。

1.2 主要試劑與儀器

腦心浸液瓊脂（BHIA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）購自英國OXOID公司，1%結(jié)晶紫染料購自北京索萊寶科技有限公司，Taq酶購自天根生化科技有限公司，瓊脂糖、電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)晶紫染色法 參照文獻 [9]中的方法檢測腸球菌生物膜形成能力并稍作修改。將凍存菌株接種于哥倫比亞血瓊脂平皿，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取菌落于0.9% NaCl 3 mL，制備0.5麥氏濁度菌懸液，隨后用TSB將菌懸液1∶200稀釋，制備含菌TSB液體培養(yǎng)基1 mL，將制備好的含菌液體培養(yǎng)基接種至Costa3599 96孔板中，每孔200 μL，每株菌3個復(fù)孔，37℃靜置培養(yǎng)24 h。24 h后棄去菌液，用1×PBS輕輕洗去浮游菌，每孔加入PBS 200 μL，清洗3遍；晾干后每孔用200 μL甲醇，固定10 min；棄去甲醇后，每孔加入100 μL結(jié)晶紫染料，染色15 min；流水沖洗后晾干，加入200 μL 33%乙酸脫色10 min，隨后用酶標儀測量光密度D570nm。OG1RF作為陽性對照菌株，不加菌液的肉湯作為陰性對照。

1.3.2 DNA模板制備 將凍存菌株轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血瓊脂平皿， 37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取菌落至已注入500 μL TE （pH 8.0） 的1.5 mL Eppendorf離心管，調(diào)節(jié)菌液濁度至2麥氏單位，100 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心10 min后取上清液備用。

1.3.3 生物膜相關(guān)基因檢測 采用表1中引物進行PCR擴增[10-11]，檢測臨床分離株中的esp、gelE、sprE、asa1、cylA、cylB、cylM基因。PCR體系為25 μL，引物終濃度為1 μmol/L，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min ；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠，電壓6 V/cm電泳25 min后染色讀取結(jié)果。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primers used in PCR assay

1.3.4 明膠酶活性檢測 參照文獻 [13]中的方法并稍作修改，將分離物接種到含有12%明膠營養(yǎng)肉湯的管中。37 ℃溫育24～72 h，4 ℃冷藏15 min后讀取結(jié)果。產(chǎn)生明膠酶的細菌即使在冷藏之后也會使培養(yǎng)基液化，陰性測試顯示冷藏后的完整明膠培養(yǎng)基。

1.3.5 結(jié)果分析 使用GraphPad Prism 6對數(shù)據(jù)進行分析，糞腸球菌毒力基因攜帶率與生物膜陽性率之間的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用GraphPad Prism 6、Excel對數(shù)據(jù)進行繪 圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離腸球菌來源分布

共收集1 1 2 株腸球菌菌株，其中5 2 株（46.43%）為糞腸球菌， 60株（53.57%）為屎腸球菌，菌株來源及分布情況見表2。

表2 112 株腸球菌來源及分布情況Table 2 The source of 112 enterococcal strains[n（ %）]

2.2 細菌生物膜形成能力分析

參照文獻報道，利用D570nm值將生物膜劃分為：陰性 （D570nm＜0.5），弱陽性（0.5≤D570nm＜1）， 中等陽性（1≤D570nm＜2）以及強陽性（D570nm≥2）。 OG1RF作為陽性對照，文獻報道D570nm范圍為0.5～1。結(jié)果見表3、表4。研究結(jié)果顯示：糞腸球菌相比屎腸球菌更易形成生物膜，兩者陽性率分別為63.46%和13.33%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。其中，38.46%糞腸球菌可形成中等陽性至強陽性的生物膜。

表3 52 株糞腸球菌形成生物膜的能力Table 3 The capacity of biofilm formation in 52 strains of E. faecalis

表4 60 株屎腸球菌形成生物膜的能力Table 4 The capacity of biofilm formation in 60 strains of E. faecium

2.3 毒力基因篩查

通過PCR方法，在52株糞腸球菌分離株中分別檢測了esp、gelE、sprE、asa1、fsrA、fsrB、fsrC以及細胞溶素基因cylA、cylB、cylM的攜帶率，見圖 1。因本研究中屎腸球菌生物膜陽性菌株較少，故篩查最常見的兩種毒力基因為esp和gelE，基因攜帶率分別為65.00% 和10.00%。

2.4 毒力基因與生物膜相關(guān)性分析

在52株糞腸球菌分離株中，esp、asa1、cylA、cylB、cylM和fsrB的基因攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），攜帶這些基因的菌株更易形成生物膜。而gelE、sprE、fsrA、fsrC基因攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間差異無統(tǒng)計學意義，見表 5。

圖1 2015－2017 年華山醫(yī)院糞腸球菌毒力基因攜帶率Figure 1 Frequency of virulence genes in E. faecalis isolates from 2015 to 2017 in Huashan Hospital

表5 糞腸球菌毒力基因與生物膜形成能力之間的相關(guān)性分析Table 5 Correlation between virulence genes and capacity of biofilm formation in E. faecalis

2.5 明膠酶活性分析

對臨床分離糞腸球菌進行明膠酶活性測定，共有1 5 株能夠液化明膠，推測能夠產(chǎn)生明膠酶。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)明膠酶陽性率在腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.054 1）。

3 討論

研究結(jié)果顯示，糞腸球菌形成生物膜的能力高于屎腸球菌，分別為63.46%與13.33%（P＜0.001），低于歐洲地區(qū)報道的腸球菌生物膜陽性率（60%～90%），高于我國Zheng等[12]報道的47.2%陽性率。腸球菌形成生物膜的能力可能具有地域差異。本研究中，血液分離出的糞腸球菌生物膜陽性率為25.00%，膽汁分離出的糞腸球菌陽性率為17.30%，腹水分離出的糞腸球菌生物膜陽性率為19.23%，不同標本來源的糞腸球菌在生物膜形成能力方面的差異無統(tǒng)計學意義。

糞腸球菌被認為是留置醫(yī)療器械感染最常見的腸球菌菌種。Esp是一種細胞壁相關(guān)蛋白，已被證實是導(dǎo)致泌尿道細菌定植、細菌持續(xù)存在和生物膜形成的重要因素。Duprè等[14]研究顯示屎腸球菌esp攜帶率較糞腸球菌更高（71.9%比60%）。本研究結(jié)果與之相符，屎腸球菌esp攜帶率為65.00%（39/60），糞腸球菌esp攜帶率為40.38%（21/52）。有研究顯示esp對生物膜形成具有影響，在糞腸球菌尿路感染（UTI）模型中，Esp缺陷菌株顯示初始附著減少[15]，膀胱定植減少，這是因為Esp可結(jié)合纖維蛋白原和膠原等配體，并且這些配體存在于膀胱中[16]。本研究也證實esp基因的攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），然而生物膜表型在糞腸球菌和屎腸球菌中的差異性，提示屎腸球菌中esp可能不是其生物膜形成的主要因素。

gelE在不同來源的分離株中廣泛存在，但各種研究顯示該基因通常沉默，并且歸因于體內(nèi)和體外條件之間的差異，或者不存在表達所需的其他基因。本研究中，糞腸球菌的gelE、sprE與生物膜表型之間不存在相關(guān)性，這與Saffari等[17]報道的結(jié)果相同，與Zheng等[12]報道的結(jié)果相反，這可能與標本來源不同有關(guān)，本研究中標本全部來自無菌體液，而Zheng等[12]研究中的菌株主要分離自尿液（203/240）。

細胞溶素在動物感染腸球菌模型中被證實與心內(nèi)膜炎以及眼內(nèi)炎有關(guān)，由cylA、cylB、cylM等基因編碼。本研究檢測了糞腸球菌中cylA、cylB、cylM基因攜帶率，分別為46.15%、48.08%、50.00%，分析結(jié)果顯示，這3種基因攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），攜帶cylA、cylB、cylM基因的菌株更易形成生物膜。另外，本研究顯示asa1和fsrB基因攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

近年來，學者們一直在研究耐藥與毒力、生物膜之間的關(guān)系。有報道顯示紅霉素耐藥腸球菌相較敏感菌株更易形成生物膜[18]。本研究并未發(fā)現(xiàn)紅霉素耐藥與生物膜陽性率之間的相關(guān)性，但發(fā)現(xiàn)esp、cylA、cylB、cylM基因的攜帶率在高濃度慶大霉素、紅霉素耐藥和敏感菌株之間的差異具有統(tǒng)計學意義（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表），具體機制需要進一步研究探討。

總之，本研究顯示糞腸球菌較屎腸球菌更易形成生物膜；在糞腸球菌分離株中發(fā)現(xiàn)多種毒力基因與生物膜形成相關(guān)，這提示生物膜的形成并不是由單一基因調(diào)控，而是由多個基因多系統(tǒng)調(diào)控。本文報道的腸球菌臨床分離株生物膜和毒力基因的比較分析結(jié)果，可作為進一步研究腸球菌感染發(fā)病機制的基礎(chǔ)。