兒童腸道定植耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌的流行病學(xué)與主動(dòng)篩查研究進(jìn)展

徐 琪， 張 泓

腸桿菌科細(xì)菌是人體腸道內(nèi)的主要定植菌，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE）的檢出不斷增多，已成為威脅公眾健康的一大難題。據(jù)報(bào)道，腸桿菌科細(xì)菌可在社區(qū)或醫(yī)院環(huán)境中通過(guò)空氣、接觸等方式進(jìn)行傳播、定植或感染。而CRE定植是臨床CRE感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，在ICU，定植的CRE增加了患者感染和死亡的風(fēng)險(xiǎn)[2]。兒童作為一個(gè)特殊群體，一旦出現(xiàn)CRE感染，將會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的后果。本文就CRE在兒童患者中的流行現(xiàn)狀、腸道定植及主動(dòng)篩查方法展開(kāi)綜述。

1 CRE流行現(xiàn)狀

CRE自2001年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，隨后全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)暴發(fā)流行趨勢(shì)。美國(guó)CDC的一項(xiàng)研究指出，2001－2011年十年間，美國(guó)CRE在腸桿菌科中的檢出率由1.2%上升至4.2%，其中肺炎克雷伯菌耐藥率從1.6%上升至10.4%[3]。國(guó)內(nèi)，2018年CHINET監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%和2.9%上升到了2018年的25%和26.3%，此外，肺炎克雷伯菌在革蘭陰性桿菌中所占比例亦逐年呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)，2018年高達(dá)20.7%[4]。在兒童患者中，2017年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告年度數(shù)據(jù)表明，兒童碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的比例均高于成人[5]，應(yīng)引起高度重 視。

據(jù)報(bào)道，腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制主要為產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜孔蛋白缺失或突變、外排泵過(guò)度表達(dá)以及青霉素結(jié)合蛋白變異等，其中最主要的是產(chǎn)碳青霉烯酶。碳青霉烯酶按照Ambler分子分類方法可分為A、B、D三類，報(bào)道最多的為A類中KPC型，以KPC-2和KPC-3型為主[6]，廣泛流行于美國(guó)、希臘、意大利、以色列、中國(guó)等。近年來(lái)，KPC在兒童患者中的檢出率也不斷上升[7]。B類金屬酶中NDM型最為常見(jiàn)，目前以印度、巴爾干半島和中東地區(qū)多見(jiàn)。兒童是NDM-1的易感人群，兒科是NDM-1檢出最多的科室之一[8]。國(guó)內(nèi)研究指出不同于成人患者主要產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶，兒童分離的CRE菌株主要產(chǎn)NDM-1型金屬酶[9]。D類碳青霉烯酶以O(shè)XA-48最多見(jiàn)，廣泛分布于北非、中東等地區(qū)，我國(guó)已有產(chǎn)OXA型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌所致新生兒感染流行的報(bào)道[10]。

2 腸道定植情況

CRE在全球范圍內(nèi)廣泛播散，在過(guò)去10～15年已逐漸成為醫(yī)療保健相關(guān)感染的重要病原[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，患者入院時(shí)C R E 定植并不常見(jiàn)（3.9%），醫(yī)療機(jī)構(gòu)是CRE傳播的主要儲(chǔ)存庫(kù)[12]。在最近2周住院時(shí)間＞48 h或長(zhǎng)期居住于醫(yī)療護(hù)理機(jī)構(gòu)的患者中分離出CRE，定義為醫(yī)院獲得性CRE[13]。CRE定植是指可以從人體分離出細(xì)菌但無(wú)臨床感染癥狀，主要定植部位為人體的腸道，當(dāng)各種因素導(dǎo)致菌群失調(diào)、免疫防御功能下降后，CRE大量繁殖或易于侵入機(jī)體，從而引發(fā)感染。在CRE定植菌株中，以耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌為主[13-14]。

在兒童患者中，CRE腸道定植的易感人群主要為新生兒及ICU患兒，與這些科室患兒基礎(chǔ)疾病嚴(yán)重、侵襲性操作多、住院時(shí)間長(zhǎng)、碳青霉烯類及其他抗菌藥物長(zhǎng)期應(yīng)用有關(guān)[15]，近期手術(shù)史和機(jī)械通氣也是CRE定植重要的危險(xiǎn)因素[16-17]。此外，胎齡越小、體重越低的早產(chǎn)兒定植的概率越大[18]，出生體質(zhì)量≤1 500 g的新生兒醫(yī)院感染發(fā)病率最高[19]。CRE定植與所采用的喂養(yǎng)方式也有關(guān)，母乳喂養(yǎng)最為安全[20]。

對(duì)ICU住院患者CRE定植的危險(xiǎn)因素分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，是否存在多重耐藥（MDR）菌是ICU患者CRE定植最重要的危險(xiǎn)因素，分離出MDR菌的患者CRE定植風(fēng)險(xiǎn)是未分離患者的5倍左右[21]。在一項(xiàng)對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)住院患者的長(zhǎng)期研究中也發(fā)現(xiàn)，CRE攜帶者比非攜帶者M(jìn)RSA和萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌（VRE）的菌株分離率更高[22]。

CRE定植是感染發(fā)生的前提條件，有研究發(fā)現(xiàn)，ICU的CRE定植患者腸桿菌科細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)至少增加了2倍，CRE定植是發(fā)生感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。還有研究顯示，近50% CRE定植患者在30 d內(nèi)發(fā)生了CRE感染，與非定植患者相比，CRE感染率增加了10.8倍，CRE定植與隨后發(fā)生CRE感染和死亡的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[2]。同時(shí)，CRE定植是遷移到其他部位導(dǎo)致感染的重要危險(xiǎn)因素，入院時(shí)腸道定植患者與非定植患者其他部位感染率分別為16%和3%[23]。

CRE通過(guò)可移動(dòng)遺傳元件在菌株間實(shí)現(xiàn)耐藥基因的廣泛播散[24]，CRE定植和感染患者共同作為院內(nèi)CRE傳染源，患者間的交叉?zhèn)鞑ゼ盎颊吲c醫(yī)護(hù)人員直接接觸是主要的傳播途徑[25]，此外，還可通過(guò)物體表面接觸等途徑傳播，使得CRE院內(nèi)定植更為普遍，且影響預(yù)后。Ballo等[26]發(fā)現(xiàn)在急性髓細(xì)胞性白血病的患者中CRE定植較未定植者60 d、90 d、1年、2年生存率顯著下降。CRE定植或感染加重患者疾病和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也使社會(huì)和醫(yī)院治療費(fèi)用增加[27]，并且隨著MDR、XDR菌株的出現(xiàn)，臨床必須引起足夠重視，否則將面臨無(wú)藥可用的境地[28]。

3 CRE主動(dòng)篩查方法

美國(guó)CDC和ECDC指南及WHO 2017年公布的《世界衛(wèi)生組織耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌、耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌和耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌預(yù)防和控制指南》均推薦對(duì)CRE進(jìn)行主動(dòng)篩查[29-31]。CRE主動(dòng)篩查的方法較多，主要包括肉湯培養(yǎng)法、含碳青霉烯類藥物的自建法、各種顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)以及PCR技術(shù)等。見(jiàn)表1。

3.1 肉湯培養(yǎng)法

美國(guó)CDC推薦對(duì)腸道定植CRE患者主動(dòng)篩查的方法是將直腸或肛周拭子標(biāo)本接種于含有10 μg美羅培南或厄他培南的5 mL胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中，隨后在（35±2）℃環(huán)境下過(guò)夜培養(yǎng)。第二天取100 μL肉湯轉(zhuǎn)種至麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，再次于（35±2）℃環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜。最后，挑取乳糖發(fā)酵的菌落進(jìn)行菌種水平的鑒定[32]。該方法對(duì)材料、設(shè)備要求不高，對(duì)操作人員技術(shù)要求也較低，基層臨床實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展，但操作過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)（約4 d），且僅適用于乳糖發(fā)酵的腸桿菌科細(xì)菌的篩查。

3.2 含碳青霉烯類藥物的自建法

通過(guò)在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上直接粘貼碳青霉烯類藥敏紙片或配制添加有碳青霉烯類藥物溶液形成具有一定藥物濃度的麥康凱平皿進(jìn)行CRE篩查。兩種方法均具有簡(jiǎn)便、可靠、靈敏度和特異度較高等優(yōu)點(diǎn)，但是Blackburn等[33]在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上分別粘貼10 μg的亞胺培南、美羅培南以及厄他培南紙片對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比篩查后發(fā)現(xiàn)當(dāng)分離株濃度較低（10 cfu/mL）時(shí)篩查靈敏度降低[33]，且目前對(duì)于抑菌圈直徑大小尚無(wú)統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)

顯色培養(yǎng)基是新一代培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的顯色底物可與細(xì)菌代謝產(chǎn)生的酶發(fā)生反應(yīng)，顯示出不同的顏色，因此可通過(guò)觀察菌落顏色實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的初步鑒定。目前常見(jiàn)的顯色培養(yǎng)基包括CHROM agar KPC、SUPERCARBA medium、ChromID ESBL、Brilliance CRE Agar、Brilliance ESBL agar等。在一項(xiàng)對(duì)產(chǎn)KPC-2和VIM-1肺炎克雷伯菌的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，CHROM agar KPC顯色培養(yǎng)基對(duì)CRE的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）和陰性預(yù)測(cè)值（NPV）分別可達(dá)100%和98.8%[34]。另一項(xiàng)研究顯示CHROM agar KPC顯色培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的靈敏度和特異度分別為88.5%和86.1%[35]，但是對(duì)產(chǎn)OXA-48的CRE菌株靈敏度僅43%，因此不能保證對(duì)此類菌株篩查的準(zhǔn)確性[36]。SUPERCARBA medium顯色培養(yǎng)基對(duì)于所有產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE分離株靈敏度高，達(dá)95.6%～96.5%[36]。Amar等[37]在產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌分離株的篩查對(duì)比試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SUPERCARBA medium顯色培養(yǎng)基與CHROM agar KPC顯色培養(yǎng)基和含亞胺培南的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基相比具有更高的靈敏度，三者分別為83%、65%和69%。顯色培養(yǎng)基是一種快速的CRE篩選方法，具有靈敏、便捷、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，但是嚴(yán)重依賴所篩查的分離菌株，且培養(yǎng)結(jié)果在許多流行地區(qū)不能進(jìn)行進(jìn)一步的分析[38]。

表1 常見(jiàn)CRE 主動(dòng)篩查方法比較

3.4 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)包括傳統(tǒng)PCR、多重PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等均可用于CRE主動(dòng)篩查，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增，從而迅速準(zhǔn)確地檢測(cè)出碳青霉烯酶型別。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)尚可實(shí)現(xiàn)對(duì)耐藥基因的定量檢測(cè)，特異度更高，在對(duì)ICU患者的直腸拭子采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行OXA-48酶的CRE篩查，整體靈敏度和特異度分別高達(dá)95.7%和100%[39]。PCR技術(shù)已被證實(shí)對(duì)CRE的快速檢測(cè)具有較高的靈敏度和可靠性，但是限于設(shè)備和操作條件，較難在基層醫(yī)院推廣。

對(duì)于CRE篩查方法的選擇，目前國(guó)際上尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室需要根據(jù)其所在地區(qū)的CRE流行病學(xué)、周轉(zhuǎn)時(shí)間要求和現(xiàn)有資源確定其實(shí)驗(yàn)室的最佳方法[40]。

4 防控措施

4.1 接觸預(yù)防與隔離

直接或間接接觸患者或患者周圍環(huán)境均可能造成CRE的傳播，因此在照護(hù)受CRE侵襲或感染的患者時(shí)，應(yīng)采取接觸預(yù)防措施。包括患者的合適安置；使用個(gè)人防護(hù)設(shè)備；限制患者運(yùn)送和轉(zhuǎn)移；使用一次性或患者專用的醫(yī)療設(shè)備；優(yōu)先清潔和消毒患者病房[31]。患者隔離是接觸預(yù)防的重要組成部分，可以采取單間隔離或?qū)⒍ㄖ病⒏腥鞠嗤退幉≡w的患者集中收治，有效避免了CRE的交叉?zhèn)鞑ァ?/p>

4.2 手衛(wèi)生

手衛(wèi)生是減少微生物傳播、預(yù)防醫(yī)療保健相關(guān)感染最重要且經(jīng)濟(jì)有效的措施[41]，是切斷CRE傳播途徑的核心一環(huán)。研究結(jié)果顯示，隨著手衛(wèi)生依從性的不斷提高，MDR菌感染/定植率逐步下降，兩者呈負(fù)相關(guān)[42]。因此必須要加強(qiáng)醫(yī)療衛(wèi)生部門(mén)手衛(wèi)生宣傳、教育及培訓(xùn)工作，此外，醫(yī)療機(jī)構(gòu)必須確保手衛(wèi)生設(shè)施，必要時(shí)監(jiān)測(cè)醫(yī)護(hù)人員依從性并進(jìn)行反饋。

4.3 其他

除了以上幾種防控措施，針對(duì)新生兒醫(yī)院感染的預(yù)防提倡采取母乳喂養(yǎng)，使用生物活性物質(zhì)、腸道益生菌及乳鐵蛋白等措施也可獲益[43]。此外，要重點(diǎn)關(guān)注抗菌藥物的合理使用，尤其是頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素。總之，醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理部門(mén)要從整體、全局出發(fā)，加強(qiáng)病原菌和耐藥菌的檢測(cè)，要認(rèn)識(shí)CRE只是耐藥菌中的一種，應(yīng)整體應(yīng)對(duì)才能使其得到控制。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

CRE腸道定植在兒童患者中廣泛存在，抗感染治療形勢(shì)嚴(yán)峻。臨床應(yīng)該積極采取預(yù)防控制措施，全方位把控CRE在醫(yī)療機(jī)構(gòu)中的流行，控制感染的進(jìn)一步播散。加強(qiáng)臨床兒童腸道定植CRE的主動(dòng)篩查，能早期發(fā)現(xiàn)定植患者，以利控制其的傳播和流行。雖然目前國(guó)內(nèi)許多醫(yī)院已經(jīng)開(kāi)展了針對(duì)高危病區(qū)CRE的主動(dòng)篩查，但是國(guó)際上對(duì)于篩查方法及篩查的主要人群、篩查標(biāo)本尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且對(duì)于CRE定植或感染的患者，是否有安全有效的方法去除定植，如何把握抗生素的使用以進(jìn)行精準(zhǔn)有效地治療，實(shí)現(xiàn)患者個(gè)體化，仍需我們進(jìn)一步的探索。