超高效液相色譜串聯質譜法檢測人肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液中奈諾沙星濃度及臨床應用

趙錦錦， 徐曉勇， 朱勇俊， 陳志明， 范亞新， 胡佳麗， 毋海蘭， 王 雨， 李 熠， 郭蓓寧， 張 菁

奈諾沙星是一種新型無氟喹諾酮類抗菌藥物，作用于細菌DNA回旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，通過抑制細菌復制起到殺菌作用[1]。該藥具有廣譜抗革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和非典型病原菌的抗菌活性，尤其是多重耐藥肺炎鏈球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[2]。蘋果酸奈諾沙星膠囊于2016年6月經國家藥品監督管理局批準上市。該藥具有口服吸收迅速完全、血藥濃度高、體內分布廣泛和生物利用度高等良好的藥動學特點[3-4]，獲批適應證為社區獲得性肺炎。

臨床前研究顯示該藥肺組織穿透性好，但目前國內外尚未見該藥在人體支氣管和肺組織中的穿透性研究報道，也未見該藥在支氣管和肺組織中濃度的檢測方法。本研究旨在建立一種超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法用于人體肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液中奈諾沙星的藥物濃度檢測，并對該方法進行驗證。因支氣管黏膜和支氣管分泌液量稀少，本研究嘗試使用0.9% NaCl溶液替代，并通過替代基質準確度考察，驗證替代基質的合理性。

檢測方法建立后可應用于人體肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液穿透性研究中的樣品檢測，以組織體液的藥物濃度和血漿藥物濃度的比值，評估奈諾沙星的肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液的穿透性[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司），API 4000-QTRAP質譜分析儀（美國AB SCIEX公司），Analyst數據處理軟件（美國AB SCIEX公司，版本號1.6.2），XS 205電子分析天平（瑞士Mettler Todelo公司），Bertin Precellys 24生物樣品均質器（法國Bertin Technology公司），B3510E-DTH超聲波清洗機（美國Branson公司），Milli-Q?IQ 7000超純水儀（密理博中國有限公司），Allegra?X-15R冷凍離心機（美國Beckman公司），MDF-U443低溫冰箱（-40 ℃）（日本Panasonic公司）。

1.2 試劑

乙腈（HPLC級）、甲醇（HPLC級）、甲酸（分析純）均為美國Sigma-Aldrich公司，超純水（HPLC級，Millipore超純水系統），0.9% NaCl溶液（醫用級，上海百特醫療公司）。

1.3 藥品

蘋果酸奈諾沙星（純度：72.2%，以奈諾沙星計；批號：E0），內標為蘋果酸奈諾沙星-D3（純度：72.39%，以奈諾沙星-D3計；同位素純度：99.9%；批號：180604-1），均由浙江醫藥有限公司新昌制藥廠提供。

1.4 色譜條件

色譜柱為ACE UltraCore 2.5 super C18（4.6 mm×50 mm，2.5 μm）；流動相：A相為0.3%甲酸水溶液，B 相為甲醇；流速：0.6 mL/ min；柱溫：35 ℃；自動進樣器設定溫度：10 ℃；進樣量：5.0 μL；洗針液：50%甲醇水溶液；分析時間：2.0 min；洗脫梯度：0～0.3 min，維持60% A；0.3～0.9 min，60%A降至30%A；0.9～1.5 min，維持30% A；1.5～1.8 min：30%A升至60%A；1.8～2.0 min，維持60% A。

1.5 質譜條件

電離源：電噴霧離子化（ESI）；檢測模式：正離子多反應監測（MRM）；噴霧電壓：4 500 V；加熱氣體溫度：450 ℃；氣簾氣： 25 psi；Gas l（氮氣）：45 psi；Gas 2（氮氣）：55 psi。奈諾沙星選擇離子通道為m/z372.5→m/ z354.5，奈諾沙星-D3為m/z375.5→m/z357.5。掃描時間均為200 ms。

1.6 空白肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液樣品來源及處理

取自1周內未服用過喹諾酮類藥物且需行肺葉切除術的患者標本。肺組織剪碎后按每0.1 g加入0.9% NaCl溶液1.9 mL，以生物樣品均質器粉碎（6 000 Hz，120 s）后離心（3 000 r/min， 10 min），取上清液制成空白肺組織樣品溶液。支氣管黏膜剪碎后按每0.01 g加90 μL 0.9% NaCl溶液，液氮反復凍融3次后超聲30 min，浸泡24 h離心（3 000 r/min，10 min），取上清液制成空白支氣管黏膜樣品溶液。支氣管分泌液按每0.1 g加400 μL 0.9% NaCl溶液，搖勻后超聲30 min，制成空白支氣管分泌液樣品溶液。上述空白樣品溶液均置于-40 ℃生物醫藥用冰箱待用。

1.7 標準曲線、質控樣品內標和工作溶液配制

精密稱量奈諾沙星標準品，加50%甲醇水溶液配制成1 000 mg/L標準曲線儲備液，加入50%甲醇溶液稀釋并配制濃度為0.400、0.800、2.00、5.00、10.0、40.0、100和200 mg/L的標準曲線工作溶液，再加入不同來源者空白肺組織樣品溶液配制得含奈諾沙星濃度為0.020 0、0.040 0、0.100、0.250、0.500、2.00、5.00、10.0 mg/L的肺組織標準曲線樣品。

精密稱量奈諾沙星標準品加50%甲醇水溶液配制成1 000 mg/L質控儲備液，加入50%甲醇水溶液稀釋并配制濃度為1.20、10.0和150 mg/L的質控工作溶液，再加入不同來源者空白肺組織樣品溶液配制成含奈諾沙星濃度為0.0600、0.500、7.50 mg/ L的樣品，分別作為肺組織低濃度質量控制樣品（LQC）、中濃度質量控制樣品（MQC）、高濃度質量控制樣品（HQC）。

同樣的方法用0.9% NaCl溶液替代人空白支氣管黏膜和支氣管分泌液溶液來配置替代基質標準曲線和質控樣品。

精密稱取蘋果酸奈諾沙星-D3（內標）標準品加50%甲醇水溶液配制成1 000 mg/L的內標儲備液，用乙腈稀釋配制成0.200 mg/L（以奈諾沙星-D3計）內標工作溶液。

上述溶液均分裝后保存于-40 ℃醫用冰箱。

1.8 生物樣品的預處理

1.8.1 肺組織樣品溶液預處理 樣品測定當日，取50 μL空白肺組織樣品溶液加入450 μL內標工作溶液（0.200 mg/L），渦漩混合5 min后12 000 r/ min離心10 min，移取200 μL上清液加入200 μL甲醇-0.1%甲酸水溶液（體積比1∶1），混勻后5 μL進樣分析。

1.8.2 替代基質樣品溶液預處理 樣品測定當日，取20 μL空白替代基質樣品（0.9% NaCl溶液）加入180 μL內標工作溶液（0.200 mg/L），渦漩混合5 min后12 000 r/min離心10 min，移取100 μL上清液加入100 μL甲醇-0.1%甲酸水溶液（體積比1∶1），混勻后5 μL進樣分析。

1.9 標準曲線計算

根據奈諾沙星與奈諾沙星-D3的峰面積之比（y）和濃度（x）之間的關系，通過最小二乘法（權重：1/x2）求得標準曲線回歸方程。以內標標準曲線法測定人肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液樣品中奈諾沙星的濃度。

1.10 方法學驗證

采用各質控濃度的肺組織和替代基質質控樣品考察方法的選擇性、批內和批間的精密度和準確度、肺組織基質效應、替代基質準確度、提取回收率以及肺組織和替代基質質控樣品在預處理前、后、室溫放置不同時間，-40 ℃凍融3次和長期放置穩定性等，結果均符合藥動學研究原則中有關生物樣品分析的要求。

1.11 血漿和組織藥物濃度的測定和穿透性評估

奈諾沙星肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液穿透性研究，入選需行肺葉切除手術的患者，術前口服蘋果酸奈諾沙星膠囊500 mg，每日1次，連續服藥（4±1）d體內藥物分布達到穩態，5例患者分別于末次服藥后2 h、5 h、9 h、12 h或24 h留取血、肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液樣品。樣品處理方法同1.6。采用上述經驗證的檢測方法測定患者肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液中奈諾沙星的濃度。

患者的血漿樣品的檢測參考Guo等[6]報道的LC-MS/MS方法，并改用同位素內標進行改良。用肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液中奈諾沙星濃度與同期血漿中的藥物濃度比值來評估奈諾沙星的組織體液穿透性。本研究藥物濃度數據均保

留3位有效數字。

2 結果

2.1 方法學驗證

2.1.1 選擇性 奈諾沙星和內標物峰形均良好，保留時間均約為0.82 min。奈諾沙星和內標的典型色譜圖見圖1、圖2，可見各空白樣品色譜峰對奈諾沙星對照品和內標峰形均無干擾，且分離良 好。

圖 1 人空白肺組織、奈諾沙星0.020 0 mg/L 肺組織和服藥患者肺組織樣品中奈諾沙星和內標的色譜圖Figure 1 Representative multiple reaction monitoring（ MRM） chromatograms for nemonoxacin and the internal standard in blank human lung tissue， lung tissue spiked with 0.020 0 mg/L nemonoxacin， and patient lung tissue

圖 2 空白替代基質、奈諾沙星0.020 0 mg/L 替代基質和服藥患者支氣管黏膜及支氣管分泌液樣品中奈諾沙星和內標的色譜圖Figure 2 Representative multiple reaction monitoring （MRM） chromatograms for nemonoxacin and the internal standard in blank surrogate matrix， surrogate matrix spiked with 0.020 0 mg/L nemonoxacin， patient bronchial mucosa and bronchial secretion

2.1.2 標準曲線及最低定量限（LLQQ） 在線性范圍0.020 0～10.0 mg/L內，奈諾沙星肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液濃度或濃度與峰面積比值間均呈良好線性關系，其中檢測下限均為0.020 0 mg/L。研究中肺組織和替代基質標準曲線線性回歸的決定系數R2范圍分別為0.998 8～0.999 1和0.993 7～0.999 0。典型的標準曲線線性回歸方程為肺組織y=0.330 8x+ 0.000 2，替代基質y= 0.213 5x-0.000 6。

2.1.3 精密度和準確度 分別配制奈諾沙星肺組織樣品和替代基質的LLOQ以及質控樣品（各5套），并在同一天內與隨行的兩套標準曲線樣品經預處理后進樣，計算批內精密度和準確度偏差。

結果顯示奈諾沙星肺組織樣品LLOQ和LQC、MQC、HQC批內和批間精密度分別≤3.5%和3.3%，準確度偏差分別≤4.5%和1.5%。替代基質樣品LLOQ和LQC、MQC、HQC批內和批間精密度分別≤5.0%和6.0%、準確度偏差分別≤11.5%和6.0%。

2.1.4 基質效應 考察6個不同來源的空白肺組織樣品對奈諾沙星和奈諾沙星-D3的質譜信號的影響。分別將濃度為0.060 0、0.500、7.50 mg/L的奈諾沙星溶液10 μL與內標基質效應考察溶液（奈諾沙星-D3，1.80 mg/L）10 μL混合，再加入180 μL空白基質（6個不同來源的空白肺組織）或甲醇-0.1%甲酸水溶液，渦漩混勻得到空白樣品處理后含藥溶液和單純含藥溶液。將上述兩種溶液進樣，按基質效應因子=空白樣品處理后含藥溶液峰面積/含藥溶液峰面積的平均值，內標歸一化的基質效應因子=待測物的基質效應因子/內標的基質效應因子×100%計算。

結果顯示在LQC、MQC和HQC下，內標歸一化基質效應因子分別為99.3%、98.0%和96.5%，變異系數均≤1.5%。

因支氣管黏膜和支氣管分泌液樣品量過少，無法考察基質效應。

2.1.5 替代基質的準確度考察 配制奈諾沙星支氣管黏膜、支氣管分泌液樣品溶液的質控樣品（各3套），并在同一天內與隨行的替代基質配制的兩套標準曲線樣品經預處理后進樣，計算質控樣品的精密度和準確度偏差，以評價替代基質能否準確測定真實基質中藥物的濃度。

結果顯示支氣管黏膜和支氣管分泌液各質控樣品精密度分別≤1.7%和≤2.8%，準確度偏差分別≤10.0%和≤10.3%。見表1。表明使用0.9% NaCl溶液可替代支氣管黏膜和分泌液基質，使用替代基質配制標準曲線和質控樣品不會對檢測的準確性產生影響。

表1 替代基質的準確度考察Table 1 Evaluation of accuracy of nemonoxacin measurement in surrogate matrix

2.1.6 提取回收率 用人混合空白肺組織樣品溶液或替代基質配制的質控樣品經預處理后進樣（6份），同時參照2.1.4中空白組織樣品處理后含藥溶液的配制方法處理，將混合空白肺組織樣品溶液和替代基質處理后含藥溶液進樣（6份），按提取回收率=質控樣品處理后的面積/混合空白基質處理后加含藥溶液面積×100%計算。

結果顯示肺組織LQC、MQC、HQC的絕對回收率均值和變異系數分別為95.3%和2.67%、95.8%和1.76%、94.0%和1.03%。總體回收率和變異系數分別為95.0%和1.0%。內標提取回收率和變異系數分別為93.1%和3.3%。替代基質LQC、MQC、HQC的絕對回收率均值和變異系數分別為102.8%和3.35%、101.3%和1.9%、104.4%和1.41%。總體回收率和變異系數分別為102.8%和1.5%。內標提取回收率和變異系數分別為103.4%和2.3%。

2.1.7 穩定性考察 肺組織和替代基質樣品預處理前室溫放置26 h后、預處理后10 ℃放置48 h、凍融3次和-40 ℃條件下放置32 d后進樣分析，回收率均在85.0%～115.0%，表明樣品均穩定。

2.2 奈諾沙星在肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液中穿透性結果

共入組需行肺葉切除術的肺癌患者5例，患者均在術前口服蘋果酸奈諾沙星膠囊500 mg，每日1次，連用3～5 d達穩態后，分別在末次服藥后不同時間于術中采集肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液樣品和同期血漿樣品。患者口服奈諾沙星500 mg后2 h、5 h、9 h、12 h、24 h的肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液中奈諾沙星藥物濃度及與血漿濃度的比值見表2。

表2 行肺葉切除術患者肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液中奈諾沙星濃度及其與血漿濃度的比值Table 2 Absolute and relative concentrations of nemonoxacin in lung tissue， bronchial mucosa， and bronchial secretion taken from patients undergoing lobectomy

3 討論

本研究建立了采集和處理肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液的方法。因肺組織血供豐富，采集患者肺組織時應選擇遠離肺門的遠端肺組織，剪碎成小塊后用0.9% NaCl溶液沖洗，再用無菌紗布擠干殘留血，可減少血液對肺組織中藥物濃度測定的影響。采集支氣管黏膜時也易受血液污染，應在剝離支氣管黏膜后立即用0.9% NaCl溶液沖洗[7]。

因空白支氣管黏膜和支氣管分泌液樣品留取較為困難且量稀少，因此在方法學驗證中以0.9% NaCl溶液作為替代基質代替空白支氣管黏膜和支氣管分泌液。對其進行了準確度考察，結果符合生物樣品分析的要求，表明可以用0.9% NaCl溶液當作替代基質配制標準曲線及質控樣品測定患者支氣管黏膜和分泌液中奈諾沙星的濃度。

尚未見國內外奈諾沙星在肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液中濃度檢測方法的報道。本研究建立的肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液UPLC-MS/MS檢測方法，具有靈敏度高、樣品分離良好、進樣量小和分析時間短等特點。在本研究建立的色譜和質譜條件下，奈諾沙星肺組織藥物的測定不受基質中內源性物質的干擾，替代基質的準確度考察也證實0.9% NaCl溶液可替代支氣管黏膜和支氣管分泌液準確測定真實基質中藥物的濃度。方法學驗證結果均符合藥動學研究原則中有關生物樣品分析的要求。因此，本研究建立的方法可為奈諾沙星組織穿透性研究中肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液樣品的檢測提供可靠手段。

肺組織穿透性研究結果顯示，患者口服奈諾沙星500 mg，每日1次，連續服藥（4±1）d，體內藥物分布達到穩態，肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液濃度均高于血漿濃度，與血漿濃度之比分別為3.72～6.56、4.03～9.51、1.18～1.88。顯示奈諾沙星在肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液中穿透性良好，結合其針對社區獲得性肺炎常見病原體殺菌效果好的特點，證明該藥適于治療社區獲得性肺炎。因受試者例數較少，且個體間存在差異，需進一步擴大患者病例數，以獲得該藥更多肺組織、支氣管黏膜和支氣管分泌液穿透性數據。