新生兒脆性X綜合征篩查對本地區CGG重復數情況分析

馬會卿 郝秀雙 劉曉玲 郭志娟 楊靈敏

脆性X綜合征是一種X染色體連鎖不完全顯性遺傳疾病(據估計外顯率為：男79%，女35%[1])，新生兒發病率0.4‰～0.67‰，占所有X連鎖智力低下疾病的15%～25%，其發病率僅次于唐氏綜合征[2]。是引起自閉癥障礙和遺傳性智力障礙最常見的單基因疾病，可表現為多動癥及不同的神經性退化[3]。可以根據CGG重復數劃分FMR1基因的不同類型：正常型為5～44個重復，以29，30個重復最為常見[4,5]；45～54個重復為中間型，又稱灰區，一般來說，此基因型攜帶者表型正常，但其后代可能發生重復單元數量變異；55～200個重復為前突變，此時CGG重復數變得很不穩定，在母親和孩子間易于發生變異，且攜帶者有幾率表現出臨床癥狀，如脆性X相關原發性卵巢功能不全及共濟失調綜合征；若CGG重復數大于200，常伴有FMR1基因異常甲基化，攜帶者表現為脆性X綜合征[5]。為有效控制脆性X綜合征的發病率，進行產前篩查及新生兒篩查是十分關鍵的措施。本文采用了PCR全長擴增與重復引物PCR擴增相結合的方法，以提高新生兒篩查準確性。共篩查992名新生兒，其中野生型984例，中間型1例，全突變男性1例。

1 資料與方法

1.1 一般資料 此科研項目通過了倫理委員會審查。并經家屬知情同意后，我院對2017年6月至2018年2月出生的新生兒隨機采集臍帶血以進行脆性X綜合征篩查，共檢測992例新生兒，其中男546例，女446例。

1.2 研究對象與樣本采集 在充分告知父母該項研究的性質、目的、內容、可預期的風險和影響等知情同意后采集樣本。新生兒篩查中采集新生兒的臍帶血。胎兒娩出后結扎臍帶，胎盤娩出后，由接生者在胎盤側近斷臍端的臍帶作為進針點，進針前先用消毒紗布擦干其表面，酒精消毒，然后抽臍靜脈血2 ml平均滴在兩個血斑上，待其自然風干后封存。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取:按照廠家說明書步驟，使用QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)提取所采集血液樣本；使用NanoDropTM(Thermo Fisher,美國)進行定量，根據檢測結果稀釋DNA樣本至50 ng/μl，保存于4℃待用。

1.3.2 PCR擴增:使用FMR1基因CGG重復數檢測試劑盒(北京閱微基因，中國)對DNA樣本進行檢測。每個檢驗包含全長擴增和重復擴增兩個體系，體系配制及PCR設置遵循廠家說明書。使用ABI VeritiTM96-Well PCR儀(Applied Biosystems,美國)進行PCR擴增。

1.3.3 毛細管電泳及結果判讀:電泳每個體系包括上述PCR產物1 μl,分子量內標QD1200 0.3 μl，Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems,美國)8.7 μl，共計10 μl。使用50 cm POP-7TM膠于ABI 3500XL DX遺傳分析儀(Applied Biosystems,美國)進行電泳分離。使用GeneMapper v5.0軟件進行分型分析，分析閾值設定為50 RFU。結果判讀標準遵循廠家說明書，全長體系和重復擴增體系可分別計算樣本CGG重復數，按說明書規定的方法綜合兩者體系的重復數讀數得出最終的CGG重復數結果。

2 結果

2.1 新生兒脆性X綜合征篩查情況 992例新生兒篩查中一次成功檢出986例，一次檢出率達99.4%。共檢出野生型984例，中間型1名、全突變1例，三種類型的基因突變圖譜如圖1所示。其中，全突變患者的CGG重復數大于200個，經隨訪發現確為來自脆性X綜合征家系的1例男性患者。見圖1。

圖1 (a)野生型(CGG重復數為28);(b)中間型(CGG重復數為29和50);(c)全突變(CGG重復數>200)

2.2 CGG重復數分布情況 986例檢出FMR1基因CGG重復數分布，共檢出28種CGG重復數，其中CGG重復數在13～44范圍內的均為正常型。正常型的CGG重復數占比圖如圖2所示，正常型的CGG重復數主要集中在29、30個重復，占全部樣本約78.2%，這與先前文獻報道一致；本研究還發現36個CGG重復是除29、30個重復外最常見的基因型，占全部樣本的約8.74%。另外，本文采用Fisher精確檢驗的方法分析男性和女性之間CGG重復數的差異，發現無顯著差異(P=0.415)，表明CGG重復數的分布情況與性別無關。見表1，圖2。

表1 986名新生兒篩查CGG重復數分布情況 例(%)

3 討論

脆性X綜合征發病率僅次于唐氏綜合征，因此進行大規模的產前及新生兒篩查很有必要。目前已有多種方法可以用于檢測脆性X綜合征，如Southern blot[6-9]、PCR法檢測甲基化[10]、PCR法檢測CGG重復序列長度[11]及重復引物PCR法[12](Repeat Primer PCR,RP-PCR)。但是以往的檢測方法存在樣本采集運輸困難，檢測時間長，通量低等各種缺陷。因此，建立一個簡便準確的篩查方法尤為重要。本研究結合CGG重復全長PCR檢測和重復引物檢測這兩種方法計算樣本的CGG重復數，可提高檢測的靈敏度并實現了CGG重復數的準確判讀。此檢測體系樣本采集運輸簡便穩定，操作簡單，檢測準確，適合用于新生兒脆性X綜合征的大規模區域性篩查。

圖2 正常型CGG重復數占比圖

我院基于該方法對近千例新生兒進行了脆性X綜合征篩查，結果表明其FMR1基因CGG重復數分布情況與以往報道相似[12]。在正常人群中，除最為普遍、常見的29、30個重復外，我們還觀察到了相對高頻(8.7%)的36個CGG重復。相對高頻的36CGG重復并非來自隨機突變，而是產生于人群亞結構。Chen等[13]最早報道了中國人群中的相對高頻的36CGG重復數現象，并通過測序確認其與一種9A9A6A9的CGG-AGG排布模式相關。后續基于其他東亞、東南亞人群的脆性X綜合征調查發現了相似的高頻36CGG重復數[14]，揭示了這一特殊重復數在東部亞洲人群中廣泛存在。而基于非亞洲人群的調查中沒有發現類似的高頻36CGG重復基因型[13,15,16]。通過SNP分析，研究者認為36CGG重復是與亞洲特有的單倍群高度相關的，這與本研究的結果相符。

此外，我們發現了一例脆性X綜合征患兒，其FMR1基因的CGG重復數>200，該患兒男性，孕足月出生，出生時體重2 700 g，大耳朵，余未見明顯異常，通過進一步對其家系的檢查，我們確認了該患兒來自一個脆性X綜合征家系，已經在該家系中至少傳遞了三代人。脆性X綜合征目前無法治愈，因存在中重度的智力障礙，對整個家庭及社會造成嚴重、長期的影響；且脆性X綜合征可以在家系中擴大，如果不加以管理，該家系后代中患病人數增加，為了預防患兒出生,應行婚前或孕前檢查脆性 X 染色體,診斷攜帶者的高危人群,以便有的放矢進行產前診斷,避免患兒出生。 脆性 X 染色體陽性者應做家系調查,發現雜合子進行遺傳咨詢和產前診斷。確診脆性 X 染色體陽性男胎兒應終止妊娠,如雜合子的女胎兒,則可能為脆性X 染色體攜帶者或者是輕度智力低下的患者[17]。這進一步說明了加強基層脆性X綜合征宣傳和加大篩查力度、倡導優生優育的重要性。

綜上所述，通過全長擴增結合重復引物擴增的方法可以有效、準確檢測出FMR1基因CGG重復數，并且此檢測體系操作較為簡便，適合用于新生兒脆性X綜合征的大規模篩查，最終達到優生優育的目。