STAT3在宮頸上皮內病變和宮頸癌中的表達及與高危型HPV感染的關系

李芳 張飛燕 郭曉丹 馬振禹 劉佳麒 賀紅梅 張偉

宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma，SCC)是全球女性中發病率僅次于乳腺癌的第二大惡性疾病。 宮頸上皮內病變(cervical intraepithelial lesion，SIL)，其能夠反映宮頸癌病癥的發生過程，也是宮頸癌前病變的主要特征。引發宮頸上皮內病變的因素多樣，在治療手段中以消融性治療與手術切除為主。信號轉導與轉錄調控因子3 (signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)為凋亡抑制基因，大量研究表明抑制這種基因的表達或功能可以抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞凋亡[1,2]。STAT作為能夠被不同細胞因子激活的蛋白，具有在不同受體中傳遞信號，充當載體的作用，這其中，又以STAT3為與腫瘤細胞關系最為密切。所以在多種腫瘤細胞中，常可以檢測到STAT3的異常表達，如對乳腺癌、淋巴癌、卵巢癌等的檢測中[3]，都可檢查出STST3激活特點。但在宮頸癌癌變過程中并與HPV感染的關系目前尚不明確。本實驗采用免疫組織化學方法，檢測STAT3在正常宮頸上皮(normal cervical epithelium，NCE)、SIL及SCC中的表達，及與高危型HPV感染的關系，以探討STAT3在SCC病變發展中的作用，為臨床預測宮頸病變的發展提供實驗室依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集保定市第二醫院病理科2014年1月至2016年12月108例患者的存檔蠟塊，均為手術切除或宮頸活檢標本。SIL患者52例，年齡22～67歲，平均年齡(36.50±2.50)歲；其中LSIL 28例(53.85%，28/52)，HSIL 24例(46.15%，24/52)。SCC患者有39例(75.00%，39/52)；病理分類結果顯示均為鱗狀細胞癌；組織學分級結果顯示，角化型鱗狀細胞癌有2例患者(5.13%，2/39)，非角化型鱗狀細胞癌有37例患者(94.87%，37/39)；參考FIGO臨床分期(國際婦產科聯盟2009年版本)標準進行，結果顯示，Ⅰa～Ⅰb期有31例患者(79.49%，31/39)，Ⅱa～Ⅱb期有8例患者(20.51%，8/39)。選取子宮肌瘤全子宮切除后的NCE 17例(NCE組)作為對照，年齡21～68歲，平均年齡(36.40±2.62)歲。所有研究對象經病理檢查確診。同時108例患者在采集組織標本前，均使用專用 HPV 標本采樣刷采集宮頸脫落細胞。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：本次研究工作中，所取標本均屬于臨床醫院實驗室診斷、臨床醫院影像學診斷、臨床病理組織學作確診；且近三個月內均無進行HPV相關治療；患者均簽署知情同意書，均配合完成本次研究工作。

1.2.2 排除標準：本次研究工作中，所得標本均排除已實施宮頸手術患者；已排除合并糖尿病患者；已排除合并其他部位惡性腫瘤疾病患者；已排除合并自身免疫功能缺陷癥患者。

1.3 STAT3蛋白表達的檢測 采用MAXVisionTM快捷免疫組化法，鼠抗人STAT3單克隆抗體(福州邁新生物試劑有限公司)檢測。以PBS液代替一抗為陰性對照。STAT3蛋白表達檢測中，以細胞漿顏色表達為檢測結果的主要依據，也可根據細胞核顏色表達為輔助的參考依據，陽性結果應表示為棕褐色。染色結果的判定應用半定量方法，每張切片觀察10個400倍視野，陽性細胞數<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、>50%為3分；細胞核或細胞漿無色判定為0分、淺黃色判定為1分、棕黃色判定為2分、棕褐色判定為3分。上述2個分值的乘積≥1為陽性，<1為陰性。

1.4 HPV檢測 應用HPV檢測試劑盒(安必平公司)，采用反向斑點雜交法，針對15種高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82)進行檢測[4]。在實施操作過程中，操作者嚴格依照試劑盒說明書進行，若檢測結果顯示，任何一種高危型HPV-DNA陽性，則可判斷為HPV陽性(+)，若高危險型HPV與低危型HPV均為陽性(+)時，則可判斷為高危HPV感染。

1.5 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，采用有序分組資料的線性趨勢檢驗作相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 STAT3在3組的表達 STAT3蛋白陽性產物為胞漿內有棕黃色顆粒。STAT3蛋白在NCE、SIL及SCC組織中的陽性表達率分別為29.41%、57.69%、89.74%，均呈逐漸增高趨勢，SCC和SIL組陽性表達率明顯高于NCE組(P<0.05),SCC組的陽性表達率也高于SIL組(P<0.05)。STAT3在SIL中的陽性表達率也隨SIL級別的升高而增高，HSIL組中STAT3蛋白的陽性表達率均高于LSIL組(P<0.05)。提示在子宮頸鱗狀上皮癌變過程中，STAT3的表達呈逐漸增高的趨勢。見表1、2，圖1、2。

表1 NCE組、SIL組、ICC組中STAT3陽性表達率 例

表2 LSIL、HSIL中STAT3、HPV的陽性表達情況 例(%)

圖1 STAT3在 SIL中的陽性表達(×400)

圖2 STAT3在ICC中的陽性表達(×400)

2.2 HPV感染率 NCE組、CIN 組及ICC組中高危型HPV的感染率分別為29.41%、76.92%和97.44%，SCC和SIL組陽性表達率明顯高于NCE組(P<0.05),SCC組的陽性表達率也高于SIL組(P<0.05)。HPV在SIL中的陽性表達率也隨SIL級別的升高而增高，HSIL組中HPV的陽性表達率均高于LSIL組(P<0.05)。提示在子宮頸鱗狀上皮癌變過程中，HPV的表達呈逐漸增高的趨勢。見表2、3，圖3。

表3 NCE、SIL、ICC中高危型HPV陽性表達率 例

A:HPV陰性;B:高危型56陽性;C:高危型16陽性

2.3 STAT3表達與高危型HPV 感染的相關性分析 相關分析證實，STAT3的過表達與高危型HPV感染存在相關性(χ2=6.123，P<0.05)。見表4。

表4 STAT3 表達與高危型HPV 感染的相關性分析 例

3 討論

隨著婦科疾病的發生率逐漸增高，婦科疾病受到的關注也越來越高，也產生了更多不同的臨床治療手段與治療措施，給予女性患者更好的臨床治療方案。宮頸癌是婦科疾病中較為常見的一類病癥，且其發病率最高，所以臨床上對于宮頸癌的治療也不斷更新治療方式，改善化療等手段，以求提高治療效率，減少對患者的損傷。作為惡性腫瘤性引發的疾病，在生存率上較低，但隨著醫療技術手段的提升，近些年來，宮頸癌的遠期生存率也在良好提升。醫學研究中對宮頸癌的研究也在不斷增多，以腫瘤標志物的探索與研究，給宮頸癌的早期診斷與治療提供了更好的參考依據，并為宮頸癌的遠期生存率提升提供了更好的支持。宮頸癌的發生、發展與多種致癌因子有關，高危型HPV感染與宮頸癌有著非常密切的關系，95%～100%的宮頸癌的發生與高危型HPV 感染相關[5]，但僅僅感染HPV病毒并不一定發生宮頸癌。目前臨床普遍認為，發生宮頸癌的高危因素為HPV病毒感染，而持續性生殖道感染HPV病毒感染則容易發生宮頸病變。相關研究數據表明，HPV病毒感染具有較顯著地域差異性，亞洲人群HPV病毒感染類型主要包括HPV16型病毒感染、HPV18型病毒感染、HPV31型病毒感染[6]。隨著患者宮頸病變逐步加重，患者HPV病毒感染陽性率也隨之升高，即提示，HPV病毒感染與人體宮頸病變的關系密切。而且，宮頸癌的發生以及發展均屬于臨床病理逐漸改變過程，自CIN早期炎性浸潤逐漸發展為癌癥，是屬于“量變到質變”過程，從HPV病毒感染逐漸進展為宮頸癌的時間約為10～20年。故此，對HPV病毒感染情況、HPV病毒感染分析進行盡早診斷，從而有效預防宮頸癌的發生。STAT3是STAT家族中與腫瘤關系最為密切的蛋白，其基因定位于第12號染色體(q13～q14-1)。STAT3蛋白可能參與多種腫瘤的形成和發展。Yang等[7]發現和正常宮頸上皮組織LSIL相比，HSIL和宮頸鱗癌組織中細胞核內STAT3的表達增高，且STAT3與Ki67在SIL中的表達呈相關關系，但與SIL的級別無關，提示STAT3在宮頸病變的發展過程中，起到了一定的作用。

HPV病毒感染并非宮頸癌疾病發生的唯一危險因素，除了HPV病毒感染，宮頸癌疾病發生與機體免疫水平、機體炎性反應、關細胞信號通路激活等具有一定相關性。信號傳導及轉錄激活因子為細胞質轉錄因子類型，該物質可以與細胞核內DNA相關結合，以及參與至靶基因調控，進而起到介導一系列病理生理活動，這其中又包括腫瘤細胞的增值、轉移與腫瘤細胞凋亡等。因此，信號傳導及轉錄激活因子可以作為惡性腫瘤發生的重要調控因子以及病情進展重要調控因子。臨床相關研究結果發現，信號傳導及轉錄激活因子與胃癌復發、胃癌轉移的關系密切，通過促使STAT3蛋白信號轉導通路受阻，從而有效減少患者機體耐藥性，提高其臨床治療效果。此外，臨床相關研究結果發現，多種惡性腫瘤疾病發作、發展均與STAT3基因存有一定相關性[8]。

信號轉導和轉錄激活因3(STAT3)是于1993年對γ-干擾素誘導細胞基因表達研究中，首次發現的重要信號分子。STAT3作為信號蛋白，其能夠起到傳遞信號的作用，將細胞外的信號傳遞于細胞內，并誘導轉錄形成基因表達作用。在STAT3蛋白中，其本身具有基因編碼作用，氨基酸組成結構與序列完整，具有多個功能區域，能夠在傳遞信號的過程中受其他因素的影響所激活，并發揮作用。一般來說，在不同的細胞結構中，STAT3的作用不同，其具有促進細胞增值的作用，與具有促進表皮細胞小管生長的作用，或能夠在巨噬細胞中發揮抗炎作用等等，于不同的細胞中誘導不同的基因組產生[9]。STAT3在腫瘤細胞中的作用具有特殊性，許多的腫瘤細胞株需要STAT3保持其轉變后的表現形式，這也側面暗示了STAT3可以作為腫瘤細胞的癌基因存在，其通過與腫瘤細胞的密切聯系，受到了腫瘤細胞的激化，同時也促進了腫瘤細胞增值。

STAT3受到腫瘤細胞的作用激活后，能夠進一步促進腫瘤細胞的增值，加強STAT3的表達，屬于正向反饋作用，其通過增強抗凋亡細胞的表達來抑制細胞凋亡，使得細胞生長與凋亡失衡，且同時還增強細胞周期蛋白表達，使得細胞異常增殖與生長，更造成細胞生長機制的失衡。在促進腫瘤細胞生長上，STAT3還通過激活表達的方式，為腫瘤細胞侵襲提供支持，例如以分泌趨化因子的方式，使得腫瘤細胞不受免疫調節與抵抗，造成腫瘤細胞增值與擴散。實際上，STAT3為腫瘤細胞提供了很好的生存環境，其通過各種方式促進腫瘤細胞增值，減少腫瘤細胞受機體內部調節影響，造成腫瘤細胞癌變的抑制效果減弱，使得癌變更加快速。臨床研究中顯示，人類多種腫瘤疾病中，如肺癌疾病、乳腺癌疾病、卵巢癌疾病、頭頸部鱗狀細胞癌疾病、多發性骨髓瘤疾病、白血病等均可檢測存在STAT表達[10,11]。STAT3作為信號蛋白，其多與腫瘤細胞形成信號通路，特別是在惡性腫瘤中能夠呈現出高表達狀態，臨床上以檢測STAT3對腫瘤病情發生情況進行驗證具有實際效果。更重要的是，STAT3能夠在腫瘤病變過程中形成促進效果，使得病情發展加快，惡化病情，其通過抑制細胞凋亡，促進細胞異常增殖的方式，造成腫瘤細胞的增值與轉移[12,13]。以對比分析的方式對STAT3的表達情況進行分析，在100份食管鱗狀上皮細胞癌組織的免疫分析中，STAT3的表達率高達73%，而在100份正常食管上皮組織的免疫分析中，皆無 STAT3表達，表達率為0，這都能夠說明STAT3可以作用檢測腫瘤細胞的指標。STAT3的表達與淋巴結轉移、 TNM 分期呈負相關。相關臨床研究運用免疫組化方法進行研究56例CIN患者病變組織中STAT3和Ki-67蛋白表達，研究結果可知，p-STAT3染色重點處于核內，且CINⅢ組織陽性表達率、CINⅠ/Ⅱ中陽性表達率分別為76．92%，13．33%，將2組數據比較，存有差異有臨床統計學意義(P<0.001)[14]。提示，CIN分級、細胞增殖均與p-SA-TA3異常表達存有一定有關性，可以作為CC預后的評價新指標。本研究結果顯示，SC組中STAT3的陽性表達率高于NCE組和SIL組，提示STAT3蛋白異常表達在宮頸病變發生與進展中發揮重要作用。

宮頸癌的發生與宮頸上皮細胞的失衡有直接關系，這其中表現為細胞生長與凋亡的失衡，正常的細胞凋亡被抑制，且細胞增殖出現無限制性異常增殖情況，也間接造成了癌細胞的產生，進而引發宮頸癌[15,16]。而抑制細胞凋亡的因素多樣，STAT3的激活是主要因素之一[17,18]。本次研究結果表明，隨著宮頸病變的進展，宮頸鱗狀細胞癌組的STAT3表達最為強烈，且根據研究結果顯示，STAT3在過度激活的的狀態下如進入宮頸癌變期，能夠呈現出高表達狀態，所以通過對STAT3的檢測也能夠反映宮頸癌病情發展情況。另外本研究證實，STAT3 的過表達與高危型HPV 感染存在相關性，而且關系較密切，提示高危型HPV 的持續感染可能激活STAT3，增加 STAT3 在宮頸組織中的表達，研究表明 STAT3 在 HPV 介導的宮頸癌發生過程中起重要作用從而影響宮頸癌的發生發展[19,20]。

綜上所述，結合STAT3的表達特點，臨床結合宮頸上皮內病變、宮頸癌以及高危型HPV感染的疾病特點，在宮頸上皮內病變(SIL)和宮頸鱗狀細胞癌(SCC)發生與發展中均具有重要作用，可以作為宮頸鱗狀細胞癌(SCC)患者預后不良的客觀判斷指標，以及臨床科學性、個體化及指導治療依據。