健脾補(bǔ)腎方對(duì)再生障礙性貧血患者免疫T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的影響

曹宇峰 張琳琳 呂麗麗 王磊 邊月平

再生障礙性貧血(AA)是由于理化因素、遺傳因素、病毒感染等多種因素引起造血干細(xì)胞質(zhì)/量異常，從而導(dǎo)致骨髓增生極度減低和全血細(xì)胞減少的一種血液系統(tǒng)難治性疾病[1-3]。目前認(rèn)為，AA發(fā)生發(fā)展與T細(xì)胞免疫功能異常、造血微環(huán)境調(diào)節(jié)紊亂及細(xì)胞因子分泌失調(diào)等因素導(dǎo)致骨髓免疫損傷有關(guān)[4-6]。本課題組采用健脾補(bǔ)腎方治療AA，以AA患者外周血免疫T細(xì)胞、血清細(xì)胞因子及外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)為指標(biāo)，進(jìn)一步深入研究健脾補(bǔ)腎方發(fā)揮治療作用的免疫學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2018年6月我院收治的AA患者90例，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，每組45例。對(duì)照組男25例，女20例；年齡32～61歲，平均(39.12±5.42)歲；病程1～12年，平均(5.12±0.73)年；中醫(yī)證候分型：脾腎陰虛型10例，脾腎陽虛型19例，脾腎陰陽兩虛型16例；治療組男23例，女22例；年齡30～65歲，平均(40.00±5.51)歲；病程1～14年，平均(5.78±0.82)年；中醫(yī)證候分型：脾腎陰虛型12例，脾腎陽虛型18例，脾腎陰陽兩虛型15例。2組年齡、性別比、病程、中醫(yī)證候分型等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=45

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》制定的再生障礙性貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)臨床癥狀體征、血常規(guī)指標(biāo)、骨髓涂片及病理學(xué)檢查確診為AA；(2)符合《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》制定的中醫(yī)辨證分型診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)入組前2周內(nèi)未接受過激素、化療藥物治療者；(4)患者均自愿參加本研究，且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并PNH、白血病等其他血液系統(tǒng)疾病；(2)合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者；(3)妊娠或哺乳期女性；(4)對(duì)本研究藥物過敏或有禁忌癥者。

1.3 治療方法 對(duì)照組給予環(huán)孢素A治療，口服，4 mg·kg-1·d-1，2次/d；同時(shí)根據(jù)病情給予抗感染、補(bǔ)血及止血藥物。治療組給予健脾補(bǔ)腎方治療，組成：黃芪 24 g，女貞子 15g，太子參 24 g，白術(shù)芍 15 g，炒丹皮 15 g，制半夏 10g，小薊草 15 g，菟絲子 24 g，炒枳殼 10 g，炙甘草 6 g。1個(gè)月為1個(gè)療程，共治療2個(gè)療程。針對(duì)不同中醫(yī)辨證分型，健脾補(bǔ)腎方中分別配伍不同中藥，脾腎陰虛型可選擇滋陰生精的藥物，如生地黃、黃柏等；脾腎陽虛型可選擇填精助陽的藥物，如補(bǔ)骨脂、淫羊藿；脾腎陰陽兩虛型可選擇陰陽雙補(bǔ)的藥物，如杜仲、制首烏等。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 外周血免疫T細(xì)胞:分別于治療前后抽取患者外周血5 ml，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定免疫T細(xì)胞比例，包括Th、Tc、NK、Th17、Treg細(xì)胞，計(jì)算Th/Tc、Th1/Th、Th17/Treg比值。

1.4.2 PBMCs轉(zhuǎn)錄因子表達(dá):采用Real time-PCR法測(cè)定PBMCs T-bet、GATA-3、RORγ、Foxp3 mRNA表達(dá)。按照TRizol說明書進(jìn)行骨髓基質(zhì)細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄，SYBR Green染料法進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，根據(jù)RQ=2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。見表2。

1.4.3 血清細(xì)胞因子:分別于治療前后抽取患者外周血5 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定TGF-β1、IFN-γ、TNF-α水平。

表2 Real time-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 2組外周血淋巴細(xì)胞亞群比較 治療前2組外周血Th、Tc、NK細(xì)胞比例及Th/Tc比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組外周血Th、NK細(xì)胞比例及Th/Tc均明顯高于治療前，Tc細(xì)胞比例均明顯低于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組Th、NK細(xì)胞比例及Th/Tc高于對(duì)照組，Tc細(xì)胞比例低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

2.2 2組外周血Th1、Th2細(xì)胞比較 治療前2組外周血Th1、Th2細(xì)胞比例及Th1/Th2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組外周血Th1細(xì)胞比例及Th1/Th2均明顯低于治療前，Th2細(xì)胞比例均明顯高于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組Th1細(xì)胞比例及Th1/Th2低于對(duì)照組，Th2細(xì)胞比例高于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

2.3 2組外周血Th17、Treg細(xì)胞比較 治療前2組外周血Th17、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組外周血Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg均明顯低于治療前，Treg細(xì)胞比例均明顯高于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg低于對(duì)照組，Treg細(xì)胞比例高于對(duì)照組(P<0.05)。見表5。

組別Th(%)Tc(%)Th/TcNK(%)對(duì)照組 治療前26.87±4.2541.34±6.230.68±0.129.53±1.24 治療后31.29±4.62?37.00±5.48?0.85±0.14?12.89±1.67?治療組 治療前27.20±4.3140.85±6.180.70±0.139.56±1.29 治療后35.99±5.11?#32.32±4.86?#1.13±0.17?#15.90±2.16?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05

組別Th1(%)Th2(%)Th1/Th2對(duì)照組 治療前0.53±0.080.32±0.041.62±0.23 治療后0.44±0.06?0.50±0.07?0.89±0.11?治療組 治療前0.55±0.090.30±0.051.60±0.25 治療后0.31±0.04?#0.78±0.11?#0.42±0.06?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05

組別Th17(%)Treg(%)Th17/Treg對(duì)照組 治療前1.23±0.183.11±0.420.43±0.05 治療后0.76±0.11?3.98±0.48?0.22±0.03?治療組 治療前1.20±0.163.08±0.400.41±0.06 治療后0.39±0.06?#4.84±0.53?#0.10±0.02?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05

2.4 2組血清細(xì)胞因子水平比較 治療前2組血清TGF-β1、IFN-γ、TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組血清TGF-β1水平均明顯高于治療前，IFN-γ、TNF-α水平均明顯低于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組TGF-β1水平高于對(duì)照組，IFN-γ、TNF-α水平低于治療組(P<0.05)。見表6,圖1。

2.5 2組PBMCs轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)比較 治療前2組PBMCs T-bet、GATA-3、RORγ、Foxp3 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組PBMCs T-bet、RORγ mRNA表達(dá)均明顯低于治療前，GATA-3、Foxp3 mRNA表達(dá)均明顯高于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組T-bet、RORγ mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，GATA-3、Foxp3 mRNA表達(dá)高于治療組(P<0.05)。見表7,圖2。

組別TGF-β1IFN-γTNF-α對(duì)照組 治療前74.32±10.1480.44±10.89285.76±24.56 治療后118.65±12.54?58.32±8.56?199.54±15.87?治療組 治療前73.68±9.7982.05±12.43292.65±28.55 治療后150.23±14.52?#33.42±4.10?#86.76±11.43?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05

圖1 ELISA測(cè)定細(xì)胞因子水平

注：與治療前比較,*P<0.05;與對(duì)照組比較,#P<0.05

組別T-bet mRNAGATA-3 mRNARORγ mRNAFoxp3 mRNA對(duì)照組 治療前0.98±0.130.31±0.041.24±0.200.40±0.06 治療后0.69±0.08?0.52±0.07?0.79±0.13?0.65±0.08?治療組 治療前1.02±0.160.33±0.051.21±0.170.41±0.05 治療后0.42±0.05?#0.89±0.12?#0.30±0.05?#0.98±0.14?#

注：與治療前比較,*P<0.05;與對(duì)照組比較,#P<0.05

3 討論

圖2 Real time-PCR法測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

注：與治療前比較,*P<0.05;與對(duì)照組比較,#P<0.05

研究表明，骨髓微環(huán)境中的多種因素能夠調(diào)控T細(xì)胞亞群的增殖、分化過程。其中轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控T細(xì)胞亞群定向分化中的作用尤為重要。T-bet、GATA-3分別是Th1、Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子，二者間具有相互調(diào)節(jié)和抑制作用，T-bet/GATA-3是反映Th細(xì)胞失衡的敏感性指標(biāo)。而RORγ是Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，具有促進(jìn)Th17細(xì)胞分化并抑制Treg細(xì)胞分化的作用。Foxp3是Treg細(xì)胞特征性的分子標(biāo)志物，具有調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞發(fā)育、分化及免疫耐受等作用[15,16]。Du等[17,18]研究顯示，AA患者PBMCs中T-bet、RORγ mRNA表達(dá)較正常人顯著升高，GATA-3、Foxp3 mRNA表達(dá)較正常人顯著降低，提示AA患者存在Th1/Th2、Th17/Treg失衡，此時(shí)Th1、Th17型免疫應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)及T細(xì)胞活化增加，從而抑制造血干/祖細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，最終導(dǎo)致骨髓造血功能衰竭。因此，檢測(cè)T-bet、RORγ、GATA-3、Foxp3表達(dá)能夠反映Th1/Th2、Th17/Treg及細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。本研究采用Real time-PCR檢測(cè)了PBMCs中T-bet、RORγ、GATA-3、Foxp3 mRNA表達(dá)，結(jié)果表明，治療后2組PBMCs中GATA-3、Foxp3 mRNA表達(dá)均明顯高于治療前，PBMCs中T-bet、RORγ mRNA表達(dá)均明顯低于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組以上指標(biāo)改善程度優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。說明健脾補(bǔ)腎方可能通過下調(diào)T-bet、RORγ表達(dá)，上調(diào)GATA-3、Foxp3表達(dá)調(diào)控T細(xì)胞的增殖、分化，糾正細(xì)胞免疫功能紊亂，并促進(jìn)造血功能恢復(fù)。

綜上所述，健脾補(bǔ)腎方治療再生障礙性貧血療效顯著，能夠有效調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能，其機(jī)制與糾正Th細(xì)胞亞群失衡，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子分泌，從而減輕T細(xì)胞免疫亢進(jìn)對(duì)骨髓造血的抑制作用。然而，由于Th細(xì)胞與轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子間存在相互作用，健脾補(bǔ)腎方作用的具體靶點(diǎn)尚需進(jìn)一步研究。