阿替普酶對腦梗死大鼠的療效觀察及對血清中GAP-43、NGF、MDA水平的影響

于海燕 王東玉 閔連秋

腦梗死發病的主要原因是腦部因血液供應不足，缺血缺氧導致腦組織出現壞死和軟化，主要發病是老年人，數據顯示，腦梗死患者年齡有年輕化趨勢，嚴重威脅者人們的身體健康[1]。阿替普酶是一種血栓溶解藥物，賴氨酸殘基與纖維蛋白結合，并激活與纖維蛋白結合的纖溶酶原轉變為纖溶酶，在治療心肌梗死上具有顯著效果[2]。血清中生長相關蛋白-43(GAP-43)參與神經發育以及軸突再生,與神經生長因子(NGF)在神經功能中發揮著重要的作用[3,4]。本文主要研究阿替普酶對腦梗死大鼠的療效觀察及對血清中GAP-43、NGF、丙二醛(MDA)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 選擇SD健康雌性大鼠30只，由錦州醫科大學實驗動物中心提供。年齡6～10周齡，平均(8.0±1.8)周；體重120～280 g,平均(240.3±120.1)g，飼養溫度22～25℃，室內濕度35%～37%，飼養室定時進行紫外線照射消毒。統一喂給標準飼料，允許它們自由活動，飼養時間為1周。

1.2 方法

1.2.1 腦梗死模型建立：選取20只大鼠進行腦梗死模型制備，給予10%的水合氯醛麻醉，把大鼠仰臥固定在實驗臺上，充分暴露其頸部皮膚，用75%的乙醇消毒后，打開大鼠頸部皮膚，利用分離針分離出頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，在遠心端結扎頸外動脈，然后在頸內動脈遠心端和頸總動脈近心端，用動脈夾阻斷循環血流。將頸外動脈在結扎處剪斷，從剪斷處插入栓線，直至頸內動脈處，然后打開頸內動脈夾，繼續推進栓線，直到遇到阻力，當阻斷大腦中動脈血流后，繼續將栓線深插入18～20 mm，最后固定栓線并縫合皮膚。2 h后再次10%的水合氯醛麻醉大鼠，把栓線拔出來，縫合傷口，75%乙醇消毒。模型制備完成以后，給予大鼠抗感染感染護理，讓其自由攝食和飲水。大鼠蘇醒后，左側表現為Horner征，提尾時右側前肢內收屈曲,右前爪不能伸展或存在右側轉圈障礙，則建模成功。手術過程中，死亡2只，感染1只，另外還有1只建模失敗，建模成功共16只。

1.2.2 分組及用藥：將建模成功的16只大鼠隨機分為模型組和阿替普酶組，每組8只，正常組大鼠10只。阿替普酶組大鼠靜脈注射阿替普酶，5 mg/kg；正常組和模型組大鼠注射等體積的無菌0.9%氯化鈉溶液，連續治療7 d。

1.2.3 腦梗死體積TTC染色：所有大鼠進行抽取股動脈血后，處死。采用0.9%氯化鈉溶液對其血液進行沖洗，將腦組織取出后，在-20℃速凍10 min，在冠狀位切取三片，每片厚度為2 mm，將組織切片在2%的TTC溶液中進行染色，注意要避光，37℃進行孵育30 min，在這一過程中要對玻片進行翻動，染色均勻，取出后在10%多聚甲醛溶液中進行24 h固定，采用Image-J圖像進行數據分析。腦梗死體積=(玻片腦梗死面積/玻片總面積)×100%。

1.2.4 腦組織含水量測定：主要采用干濕法進行。將取出的腦組織在天平上進行稱重，之后在110℃的干燥箱干燥完全脫水后，再次進行稱重，根據公式腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.5 大鼠ZeaLonga評分[5]：無神經缺損,大鼠活動正常，為0分；大鼠對側前肢不能完全伸展，為1分；大鼠行走不穩，身體出現偏癱并轉圈，為2分；大鼠身體出現偏癱并發送傾倒，為3分；大鼠不能行走，其意識完全消失，為4分，分數越高，說明大鼠神經損傷越嚴重。

1.2.6 大鼠腦組織病理學：將采集到的標本在10%的甲醛緩沖液中保持48 h，之后脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟處理后，采用HE進行染色，在顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理學特征。

1.2.7 ELISA法檢測GAP-43、NGF、MDA水平：將抽取的大鼠股動脈血在抗凝管中保存，之后使用轉速為1 000 r/min的離心機，離心處理20 min，提取血漿，放入潔凈的EP試管中，在-20℃環境中保存，待用。采用50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將標本進行溶解，濃度為10～20 μg/ml，在96孔酶標板中加入100 μl/孔，4℃過夜保存。第2天舍棄包被液，采用PBST洗滌3次，沒孔中加入1%的150 μl BSA，在37℃環境中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，加入對照樣品，37℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μl,稀釋后的HRP標記的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，之后，使用顯色劑顯色20 min后，在酶標儀上讀取A405吸收值。

1.2.8 Western blot檢測PTEN、mTOR、PKA蛋白表達：將采集到的標本，使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細胞裂解液，進行裂解35 min，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質，通過10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V,電泳10 min，結束之后，將電轉膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃環境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結合，加入TBST稀釋按(1∶1 000)稀釋一抗Tubulin(內參照)，在4℃的環境下孵育過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液清洗反復清洗。最后加入顯影劑將其僅在底物溶液中進行顯色，嚴格按照顯影定影試劑盒操作說明書進行。

2 結果

2.1 3組大鼠腦組織病理學觀察 正常組在海馬區和皮質未發現梗死，與正常的腦組織結構未發現明顯的界線；模型組在皮質發現了較大面積的梗死，并且危及海馬區，與正常的腦組織結構存在明顯的界線，周圍與神經相關的細胞數量急劇減少，出現水腫；細胞核發生固縮并且深染，核仁在逐漸消失，出現炎性細胞浸潤，細胞漿液疏松。阿替普酶組腦梗死的面積明顯減小，膠質細胞增殖，水腫現象顯著改善。見圖1。

圖1 3組大鼠腦組織病理學觀察(HE染色×200)

2.2 3組大鼠腦梗死體積、腦組織含水量、ZeaLonga評分比較 3組大鼠腦梗死體積、腦組織含水量、ZeaLonga評分比較，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組大鼠腦梗死體積高于正常組(t=27.23，P=0.00)，腦組織含水量高于正常組(t=8.19，P=0.00),ZeaLonga評分顯著高于正常組(t=9.92，P=0.00)，差異有統計學意義(P<0.05)；阿替普酶組大鼠腦梗死體積低于模型組腦組織(t=18.50，P=0.00)，腦組織含水量低于模型組腦組織(t=5.15，P=0.00)，ZeaLonga評分低于模型組(t=2.48，P=0.03)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

組別腦梗死體積(mm3)腦組織含水量(%)ZeaLonga評分(分)正常組(n=10)0.00±0.0077.45±0.450.00±0.00模型組(n=8)94.92±11.1179.62±0.631.65±0.53阿替普酶組(n=8)56.01±9.6578.28±0.420.96±0.58 F值40.8412.8014.88 P值0.000.000.00

2.3 3組大鼠血清中GAP-43、NGF、MDA水平比較 3組大鼠治療后血清中GAP-43、NGF、MDA水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組GAP-43水平顯著高于正常組(t=3.70，P=0.00)，NGF水平顯著高于正常組(t=8.34，P=0.00)，MDA水平顯著高于正常組(t=7.35，P=0.00)，差異有統計學意義(P<0.05)；阿替普酶組GAP-43水平低于模型組(t=2.24，P=0.04)，NGF水平低于模型組(t=4.57，P=0.00)，MDA水平低于模型組(t=5.78，P=0.00)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

組別GAP-43(ng/L)NGF(ng/ml)MDA(nmol/ml)正常組(n=10)0.93±0.02167.45±12.459.45±1.46模型組(n=8)1.72±0.68119.62±11.6314.65±1.53阿替普酶組(n=8)1.18±0.35148.28±13.4210.96±0.96 F值5.5512.5011.03 P值0.000.000.00

2.4 阿替普酶對腦梗死大鼠作用機制研究 3組大鼠治療后PTEN、mTOR、PKA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組PTEN表達水平高于正常組(t=7.09，P=0.00)，模型組mTOR表達水平高于正常組(t=3.19，P=0.01)，模型組PKA表達水平高于正常組(t=5.33，P=0.00)，差異有統計學意義(P<0.05)；阿替普酶組PTEN表達水平低于模型組(t=3.28，P=0.01)，mTOR表達水平低于模型組(t=2.21，P=0.04)，PKA表達水平低于模型組(t=3.55，P=0.00)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

組別PTENmTORPKA正常組(n=10)0.23±0.087.45±2.456.55±2.46模型組(n=8)0.97±0.3212.78±4.5413.66±3.21阿替普酶組(n=8)0.56±0.159.05±2.458.79±2.18 F值10.644.869.60 P值0.000.010.00

3 討論

腦梗死是一種臨床上的常見腦血管疾病，其特點是治療后高復發率、高死亡率和高致殘率，極大降低患者的生活質量。相關數據顯示，我國近些年，腦梗死的發病率有明顯上升的趨勢[6]。正常情況下，腦毛細血管與腦細胞之間存在血腦屏障，血腦屏障可以阻止有害物質進入腦組織，進而保護腦組織不受損傷，減少有害物質的侵害[7]。依靠這種方式，保持著腦組織內環境的穩態，這對于生物的生長生存具有重要的價值。腦梗死病發后，血清中炎性因子表達明顯升高，氧自由基增多，蛋白水解酶等大量表達，微血管內皮細胞遭到破壞，血腦屏障的通透性增加，一些有害物質會通過血液循環進入腦組織，而腦組織中的一些物質也可進入血液循環，進而加重疾病，特別是在腦神經元再生過程中，這種現象更加嚴重，嚴重影響患者的生命安全[8,9]。

阿替普酶屬于第三代新型的一種溶栓藥物，其特異性以及在半衰期，阿替普酶的溶栓效果表現良好。研究顯示，急性腦梗死發病時會釋放大量的炎性應激因子，在患者體內相互拮抗，其水平變化導致了局部的血流障礙[10]。阿替普酶可以有效的減少血液的粘稠度，以及凝固性，對血小板的凝聚具有顯著的抑制作用，對血管側支循環阻力有減輕效果，改善血液的微循環，同時對缺血半暗帶細胞功能具有顯著的恢復作用[11]。阿替普酶作為一種組織纖溶酶原激活劑，主要經過纖維蛋白溶解酶結合纖維蛋白溶解酶，對纖溶酶原進行激活，形成纖溶酶后起到溶解血塊的作用。阿替普酶凝血系統的影響較小，不易出血，因此其溶解血栓能力較強[12,13]。

本文研究結果顯示，阿替普酶組大鼠的腦梗死體積、腦組織含水量較少，其ZeaLonga評分較低，趨于正常大鼠，說明阿替普酶治療腦梗死效果明顯，同時可以促進大鼠神經功能恢復。分析原因：阿替普酶對毛細血管中的內皮細胞具有保護作用，保護其細胞的緊密連接的結構功能，可以有效的減輕大鼠腦梗死內皮細胞的腫脹程度，對基膜厚薄有改善作用[14]。GAP-43是一種胞膜磷酸蛋白，與神經發育、軸突再生、突觸重建有關，可以調解軸突延伸作用，改變細胞形態，還可以作為細胞內信號，大大增強與G蛋白偶聯受體之間的聯系[15]。當腦梗死發生時，腦組織損傷部位周圍神經元的傳入側支發芽，反應性軸突再生，發生功能代償性發育，使得GAP-43的表達水平升高[16]。由于血腦屏障遭到破壞，血清中的GAP-43水平也會發生相應的變化。NGF對神經生長和分化具有促進和維持作用。研究顯示，脊髓損傷的大鼠，其受傷局部NGF及其受體的水平上升，說明NGF水平升高與神經損傷有一定的相關性[17]。MDA是一種氧化應激反應的標志物，可以根據MDA水平變化了解到機體代償性變化。MDA是脂質氧化終產物，會加劇細胞膜的受損程度，還可以影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶活性。肌體大量運動時會對組織器官產生震蕩效應，使細胞內代謝產物不斷積累導致其滲透壓升高，由于細胞膜通透性的可逆性變化，胞內代謝酶逸出，導致血清酶活性升高[18]。本研究顯示，阿替普酶組大鼠GAP-43、NGF、MDA水平顯著降低。說明阿替普酶可以有效的抑制GAP-43、NGF、MDA水平。其可能的作用機制是PTEN是mTOR通路的負相關的調節因子，抑制PTEN下調，有助于激活mTOR通路，對軸突再生有顯著的阻礙作用[19,20]，GAP-43通過下調PTEN、PKA表達，激活mTOR通路，從而抑制GAP-43、NGF、MDA水平。

綜上所述，阿替普酶對腦梗死大鼠的治療效果顯著，有助于促進大鼠神經功能恢復，通過調控PTEN、mTOR、PKA信號通路，對GAP-43、NGF、MDA水平起到抑制作用。