A型肉毒毒素對增生性瘢痕組織中bFGF、caspase-3和Bcl-2表達的影響

武鳳蓮 朱東來 王連英 王嘉欣

瘢痕是各種創傷引起的正常皮膚組織的病理變化，是人類創面愈合過程中的必然結果[1]，當創面過度修復時，成纖維細胞大量增生以及膠原基質的過度沉積，可發生纖維增生性真皮損傷，并發展成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩[2]。瘢痕疙瘩是結締組織異常愈合的一種形式，其特征是過度增殖和透明變性[2]。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的病因尚不清楚，治療仍是臨床上的一個挑戰。目前的治療方法包括外科和非手術方法，如壓迫、硅膠片、冷凍療法、激光、病灶內注射類固醇、5-Fu和A型肉毒桿菌毒素(BTXA)[3,4]。瘢痕病灶內注射BTXA是目前比較有前途的預防和治療增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的方法之一。但直到現在其預防及治療瘢痕的具體機制原理尚不十分清楚[5]。本研究旨在通過A型肉毒毒素對瘢痕中bFGF、caspase-3及 Bcl-2表達的影響，進一步探討其治療增生瘢痕的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 DMEM培養基、胎牛血清(Gibco公司 USA)；BTXA(蘭州生物制品研究所)；Trizol 總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(美國 PROMEGA公司)，胰蛋白酶購于德國Merk公司；MTT、DMSO、AO/EtBr熒光劑購于SIGMA USA;BCA試劑盒(BD Parmingen 公司)；bFGF抗體、caspase-3抗體及Bcl-2抗體(CTS,英國)；光學顯微鏡，熒光顯微鏡，PCR 儀器，凝膠圖像分析系統。

1.2 實驗標本 實驗所用標本全部來源于2016至2018年秦皇島市第一醫院整形燒傷外科的門診及住院瘢痕患者。瘢痕部位包括面部、上肢，胸背部，患者近期并沒有接受激光、放射線及其他藥物治療，病程最短為3個月，最長為4年。取標本前均得到患者的知情同意。

1.3 增生性瘢痕成纖維細胞培養 將取下的手術標本按無菌操作程序用配好的抗生素生理鹽水進行反復沖洗3次后，剪去多余皮下組織后，將只保留帶表皮的瘢痕組織剪成所需大小的小組織塊，用PBS緩沖液反復沖洗干凈后接種于含有培養液的培養方瓶中，在特定條件的孵箱中進行瘢痕成纖維細胞原代的培養，根據原代成纖維細胞的生長情況進行更換培養瓶中的培養液，一般1周更換2～3次。待原代成纖維細胞爬滿瓶底即可進行傳代培養，原代細胞從組織塊中爬出到鋪滿培養瓶底一般需要3周左右的時間。本實驗所用細胞為3～6代。

1.4 實驗分組 將實驗分為5組：對照組(培養液中不加任何干擾因素)，培養液中加入A型肉毒毒素，濃度分別為0.2～1.6 U/ml。 取對數生長期的細胞，接種于6孔板中，沒孔加入2 ml培養液，待細胞貼壁后，更換無血清培養基饑餓培養24 h后，使細胞同步于G0期后，更換含10%小牛血清的DMEM，同時加入各組藥物培養24 h。

1.5 成纖維細胞增殖活力的測定 取對數生長期的瘢痕成纖維細胞,用胰酶消化后調制成為1×106/ml成纖維細胞懸浮液，96孔培養板中每孔接種200 μl的成纖維細胞。置于5% CO2，37℃培養箱培養約24至細胞長至單層。待細胞完全貼壁后去除培養液，用PBS洗1～2遍，加入用含血清的培養基稀釋得到各組BTXA濃度的藥液。每個藥物濃度組0.2～1.6 U/ml及對照組設6個復孔，每孔加 150 μl藥液,將細胞培養板分別置于培養箱中孵育24 h、48 h后棄上清，用PBS緩沖液溶液洗2遍，后每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl 繼續孵育3 h后，棄掉上清液，每孔加200 μl DMSO振蕩混勻，沉淀溶解完全后用自動酶標比色儀在波長 490 nm 處讀取吸光值(A490)時測定其OD值。計算藥物的抑制率 (IR)。IR=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%

1.6 吖啶橙和溴化乙錠(AO/EtBr)雙重染色 采用熒光染料吖啶橙和溴化乙錠(AO/EtBr)雙重染色技術檢測A型肉毒毒素對增生性瘢痕成纖維細胞形態的影響。用胰蛋白酶消化后將成纖維細胞制成1×106懸浮液接種于96孔培養板中，用濃度為0.4 U/ml,0.8 U/mlBTXA處理組細胞置于5% CO2，37℃培養箱培養約24 h后，收集細胞，PBS 洗滌2次，加入10 μl的吖啶橙和溴化乙錠染料，10 min后繼續置于37.0℃、5%(體積分數)的CO2飽和度的孵箱中繼續孵育15 min， 然后用熒光顯微鏡檢查并攝像捕獲圖像，并用Image J軟件評估。

1.7 RT-PCR 總RNA是從增生性瘢痕成纖維細胞中分離出來，將含有不同濃度(0.2、0.4、0.8、1.6 U/ml)BXTA及對照組的培養液加入對數生長的密度為1×106個/ml的成纖維細胞混懸液中，將細胞放置于孵育箱中培養24h，棄上清液收集細胞。按總RNA抽提試劑盒說明書，操作步驟按試劑盒的操作指南進行。采用 Trizol 法提取總 RNA，經NanoDrop ND-2000 紫外分光光度儀檢測完整性后于-80℃保存備用。對所有樣品取2 μg總RNA ，利用Promega公司的逆轉錄試劑盒的操作步驟進行合成 cDNA。2 μl cDNA與2 μl 引物混合，于25 μl反應體系進行擴增。將各組樣本擴增后的10 μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠掃描成像分析儀處理系統掃描各條帶紫外光吸收量(Vol)。以為β-actin內參，檢測各組bFGF、caspase-3及Bcl-2基因的Vol與內參β-actin的Vol的比值作為其mRNA的相對表達量，并比較對照組與加入不同濃度肉毒毒素作用后增生性瘢痕成纖維細胞bFGF、caspase-3及Bcl-2表達的變化,每組重復實驗3次。見表1。

表1 用primer5.0輔助設計引物

1.8 Western blotting 用Western blotting檢測各組細胞中bFGF、caspase-3及Bcl-2蛋白的表達量。用胰蛋白酶消化對數生長期的3～6代瘢痕成纖維細胞并制成1×106個/ml細胞懸液，并接種于96孔的培養板上，每孔分別接種100 μl的成纖維細胞混懸液。把接種細胞的培養板放于37.0℃、5%(體積分數)的CO2飽和濕度中常規培養24 h后棄上清液，用10%小牛血清的DMEM配制含BTX的細胞培養液，BTXA濃度為0.2～1.6 U/ml,培養液每組設6個平行孔及空白對照孔，各組加入配好的藥液200 μl后繼續孵育24 h后，收獲細胞，并用含有蛋白酶抑制的裂解緩沖液對細胞進行裂解，于4℃,10 000 r/min離心10 min，取得蛋白樣品。BCA法測定各組蛋白濃度，每個處理過的樣品用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移PVDF膜(Millipore,Bedford,UK)。10%脫脂奶粉封閉2 h后，用一抗在4℃下孵育過夜，然后室溫下用二抗孵育1 h，最后把所得樣品置于凝膠成像系統曝光。并用Image軟件分析各樣品與對照蛋白灰度比值作為目標基因蛋白的相對含量。

2 結果

2.1 A型肉毒毒素對細胞增殖的抑制作用 對數生長期的增生性瘢痕成纖維細胞在A型肉毒毒素的作用下其增殖速度減慢，同一作用時間里，中、高濃度的BTXA作用下的成纖維細胞的增殖抑制更加明顯；且同一藥物濃度作用后，作用時間的延長，成纖維細胞的抑制率也越高(P<0.05)。見表2。

BTXA濃度(U/ml)抑制率24 h48 h0(對照)0?0?0.25.51±0.7258.93±0.01020.49.16±0.09312.35±0.02560.823.67±0.03435.05±0.02311.674.01±0.07883.48±0.0257

注：與各濃度組比較,*P<0.01

2.2 A型肉毒毒素對增生性瘢痕成纖維細胞形態的影響 早期凋亡細胞用吖啶橙染色為黃綠色，凋亡晚期細胞用溴化乙錠染色為橙色。與對照增生性瘢痕成纖維細胞相比，A型肉毒毒素處理的瘢痕成纖維細胞顯示出更多的黃綠色和橙色染色的細胞，說明成纖維細胞開始出現凋亡。與對照組比較，0.4 U/ml肉毒毒素處理的成纖維細胞顯示出更多的黃綠色，在0.8 U/ml肉毒毒素處理細胞中觀察到溴化乙錠橙色染色的晚期凋亡細胞數量明顯增加，說明隨著肉毒毒素濃度的增加，成纖維細胞的凋亡的數量也增加。見圖1。

對照組0.4 U/min0.8 U/ml

圖1A型肉毒毒素對增生性瘢痕成纖維細胞形態的影響

2.3 BTXA對5組細胞中bFGF、caspase-3及Bcl-2mRNA表達的影響 與對照組比較，對用含有0.2、0.4、0.8、1.6 U/ml濃度的A型肉毒毒素的培養液孵育24 h的成纖維細胞進行RT-PCR結果顯示bFGF及Bcl-2的mRNA表達量下降，中、高濃度組明顯下降(P<0.05)；caspase-3的mRNA表達呈升高趨勢，高濃度組尤為明顯(P<0.05)。見圖2。

圖2BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞bFGF、caspase-3及Bcl-2mRNA的影響

2.4 BTXA對5組細胞中bFGF、caspase-3及Bcl-2蛋白表達量的影響 Western blotting 結果顯示，與空白對照組比較，含有0.2、0.4、0.8、1.6 U/ml濃度的A型肉毒毒素的培養液培養24 h的增生性瘢痕成纖維細胞內，bFGF及Bcl-2的蛋白表達量下降，中、高濃度組明顯下降(P<0.01)；caspase-3的蛋白表達量呈升高趨勢，高濃組尤為明顯(P<0.01)。見表3，圖3。

BTXA(U/ml)bFGFcaspase-3Bcl-201110.20.91±0.12?1.53±0.80?0.89±0.03?0.40.79±0.03?1.89±0.47?0.76±0.32?0.80.65±0.24?#2.32±0.11?#0.63±0.53?#1.60.49±0.1?#2.91±0.26?#0.56±0.31?#

注：與0比較,*P<0.05；與0.2、0.4比較，#P<0.01

圖3不同濃度BTXA(U/ml)干預后增生性瘢痕成纖維細胞bFGF、caspase-3及Bcl-2蛋白的表達

3 討論

傷口愈合治療仍然是一個巨大的臨床挑戰[6]，因為傷口愈合是一個非常動態、復雜和相互作用的過程，包括典型的炎癥階段、細胞增殖期階段和細胞外基質重塑期三個重疊的階段[7,8]。在皮膚創傷修復的過程當中，病理學上會出現異常的表現，即在愈合過程中成纖維細胞會出現過度增殖，一些相關蛋白，包括膠原蛋白、纖聯蛋白還有氨基多糖等細胞外基質會出現過度沉積，進而導致皮膚創傷后過度修復而形成增生性瘢痕。成纖維細胞是膠原母細胞，分泌膠原，在瘢痕形成中，成纖維細胞不能夠進入正常的凋亡程序，而出現異常的過度增殖，進而導致膠原的過度分泌沉積，故成纖維細胞的異常增殖在增生性瘢痕的形成和發展中起著至關重要作用[9]。目前很多研究都在嘗試用藥物治療瘢痕，通過藥物的誘導能夠使成纖維細胞進入正常凋亡程序，這是預防及治療增生性瘢痕的一個很有意義的研究方向。有多篇報道顯示A型肉毒毒素改善了增生性瘢痕的癥狀[10-12]。肉毒毒素是一種由革蘭氏陽性肉毒梭菌中提取的一種強效神經毒素，存在于多種血清型(a型至G型)中。二十多年來，應用A型肉毒毒素治療各種疾病，包括眼瞼痙攣和面部功能亢進，已被證明是安全有效的[13-15]，所以多年來，它在各種醫療條件的治療中的應用在醫學和美學上都得到了擴展。目前A型肉毒毒素的作用機制已被證明包括對傷口張力的作用、對膠原的作用和對成纖維細胞的作用。然而，A型肉毒毒素治療瘢痕的的具體分子機制尚不清楚，仍然在探索中。

本研究中，A型肉毒毒素(濃度為0.2～1.6 U/ml)作用于體外增生性瘢痕的成纖維細胞，通過MTT法檢測A型肉毒毒素對成纖維細胞有明顯抑制作用,熒光染料吖啶橙和溴化乙錠(AO/EtBr)雙重染色技術檢測A型肉毒毒素可以誘導瘢痕成纖維細胞的凋亡，并且呈濃度劑量依賴趨勢；用半定量RT-PCR測定中、高濃度的A型肉毒毒素做用的成纖維細胞中bFGF及Bcl-2的mRNA表達量明顯下降，caspase-3的mRNA表達呈升高趨勢；用Western blotting檢測各組細胞發現bFGF、Bcl-2蛋白的表達量呈下降趨勢，caspase-3的蛋白表達量升高。我們知道bFGF是一種作用廣泛的細胞因子，它在創面愈合過程中的基本生物學作用是所有相關細胞的促有絲分裂原、化學趨化及調節蛋白[16]。有人在研究細胞周期的分析過程中發現，細胞在生長、增殖、分化及凋亡的各細胞周期轉換中，bFGF可以誘導并促進細胞從G0、G1期進入S期，從而使成纖維細胞、上皮細胞和血管內皮細胞的快速增殖與分化[17]。本實驗中發現隨著A型肉毒毒素濃度的增加，bFGF的表達呈下降趨勢，說明bFGF表達的降低可能使細胞在周期轉換中停滯在G1期導致細胞DNA復制和有絲分裂產生障礙，進而加速細胞凋亡。caspase-3為半光氨酸天門冬氨酸蛋白酶的簡稱，它在細胞凋亡過程中處于很重要的位置，是細胞毒性T淋巴細胞殺傷機制的重要組成部分[18]。caspase-3是caspase家族成員中最重要的效應因子，處于凋亡有序級聯反應的下游，是多種凋亡信號通路的最終匯集點，大多數觸發細胞的因素，最終都需要通過caspase-3介導信號傳導途徑而致細胞凋亡，是凋亡的主要執行者[19]。細胞可以進入正常程序性凋亡的過程中，Bcl-2家族成員扮演著至關重要的角色，其中非常重要的成員抗凋亡和促進凋亡兩類蛋白質同屬于Bcl-2家族。

Bcl-2能夠通過抑制caspase-3、-7過度表達所誘導的凋亡，說明Bcl-2可能對下游caspase有抑制作用，參與對caspase活性的調節，但Bcl-2家族某些成員能被caspase-3所剪切，產生具有促凋亡作用的片段，導致多種細胞凋亡[20]。本實驗中隨著A型肉毒毒素濃度升高，細胞中的caspase-3表達升高，Bcl-2的表達下降。因此，兩者的負相關的表達加速了瘢痕成纖維細胞的凋亡。

本實驗中A型肉毒毒素能夠下調bFGF和Bcl-2蛋白的表達，上調caspase-3的表達，這可能是A型肉毒毒素抑制增生性瘢痕成纖維細胞增殖并誘導成纖維細胞凋亡，治療增生性瘢痕的重要機制，為A型肉毒毒素治療增生瘢痕提供更多理論基礎。