京尼平和甲醛緩釋體類防腐劑對(duì)活體兔鞏膜交聯(lián)的有效性研究

許寅聰 陳靜 趙亞芳 王超英 仝春梅 劉迎慶 韓寶雁

高度近視已經(jīng)引起了全社會(huì)的關(guān)注，近年全世界高度近視患者數(shù)量急劇增長(zhǎng)，預(yù)測(cè)到2020年全球約有20億的近視患者[1,2]，這勢(shì)必嚴(yán)重干擾了社會(huì)的正常發(fā)展。中國是高度近視的高發(fā)國家，患病率為6.69%～38.4%[3-5]。近視之所以引起全社會(huì)的關(guān)注是因?yàn)楦叨冉暿浅Ｒ姷闹旅ば匝鄄。以谥旅ば匝鄄≈械谋壤杆僭鲩L(zhǎng)。尤其是病理性近視患者，因后鞏膜終生持續(xù)擴(kuò)展，眼軸終生增長(zhǎng)，最終引起眼球后段局限或大面積缺血，進(jìn)而損害視網(wǎng)膜功能，并誘發(fā)并發(fā)癥的發(fā)生[6,7]。既往一些研究表明病理性近視的發(fā)生及并發(fā)癥的出現(xiàn)與鞏膜的生物力學(xué)降低有關(guān)[8,9]。隨著核黃素-紫外光A角膜膠原交聯(lián)手術(shù)治療圓錐角膜技術(shù)的應(yīng)用并取得良好的臨床效果[10,11]，使得病理性近視的研究有了新的方向，增強(qiáng)鞏膜生物力學(xué)的研究也成為了新的熱點(diǎn)，研究是希望通過增強(qiáng)后部1/2鞏膜的應(yīng)力、應(yīng)變、彈性模量等，起到阻止或延緩后鞏膜持續(xù)擴(kuò)展的作用，最終實(shí)現(xiàn)治療病理性近視的目的[12,13]。京尼平是一種低毒性和優(yōu)良生物相容性的天然交聯(lián)劑，我們既往研究也發(fā)現(xiàn)其具備較強(qiáng)的鞏膜交聯(lián)效應(yīng)[14]。本研究希望通過直接對(duì)比研究甲醛緩釋體類防腐劑和京尼平對(duì)活體成年兔鞏膜交聯(lián)后的后鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度的改變來衡量其有效性，最終篩選出具有較強(qiáng)鞏膜膠原交聯(lián)效應(yīng)的藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新西蘭大白兔，數(shù)量100只，來源為河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，年齡約為1年齡，雌雄不限，體重為(1.69±0.14)kg，飼養(yǎng)地點(diǎn)為聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八○醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，有中心飼養(yǎng)員進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20～23℃，每日接受日光或燈光12 h。入組前經(jīng)過便攜式筆形手電逐步檢查每只兔雙眼外眼瞼、角膜和瞳孔均未見明顯異常。本研究所涉及的所有兔動(dòng)物試驗(yàn)都已經(jīng)取得中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八○醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)2018-KY-09)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立:將100只兔隨機(jī)分為5組(隨機(jī)數(shù)字表法)，每組20只，分別為 3組FARs藥物組(羥甲基甘氨酸鈉組、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)，京尼平組和空白對(duì)照組。右眼為實(shí)驗(yàn)眼(由拋硬幣法選出)。給藥方法為：選擇鼻上1∶00和顳下7∶00位角膜緣后3 mm進(jìn)針Tenon’s囊下各1次，左眼均未予以任何處理。見表1。

表1 京尼平和甲醛緩釋體類防腐劑給藥濃度及劑量 n=20

1.2.2 鞏膜生物力學(xué)參數(shù)測(cè)量

1.2.2.1 樣本制備:最后一次給藥后60 d，5組兔體重見表2(F=0.779，P=0.549)。耳前靜脈空氣栓塞法逐組處死動(dòng)物兔，摘取實(shí)驗(yàn)眼球，保留眼外肌和視神經(jīng)，并編號(hào)標(biāo)記，然后按操作順序依次放入保存液1中，成分為25%的新生牛血清、2.5%的蔗糖、2%的DMSO、滅菌注射用水；保存液2，成分為25%的新生牛血清、5.5%的蔗糖、4%的DMSO、滅菌注射用水；保存液3，成分為25%的新生牛血清、7.5%的蔗糖、6%的DMSO、滅菌注射用水，每眼球在這3種保存液中均浸泡10 min，最終放入保存液4中，成分為25%的新生牛血清、10%的蔗糖、7.5%的DMSO、滅菌注射用水。之后帶保存液4放入編號(hào)的保存盒中密封，之后放入液氮罐中保存。連同液氮罐一起運(yùn)輸?shù)教砉ご髮W(xué)國家力學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，將密封在保存液4中的兔眼從液氮罐中取出，放入37℃恒溫水浴箱中復(fù)溫2 h，取標(biāo)本1∶00和7∶00位眼外肌止端后的鞏膜，制成長(zhǎng)10 mm寬5 mm的長(zhǎng)方形鞏膜條帶。見表2。

組別體重羥甲基甘氨酸鈉組1.61±0.19重氮咪唑烷基脲組1.67±0.14惡唑烷組 1.69±0.10京尼平組 1.67±0.13空白對(duì)照組 1.66±0.17

1.2.2.2 生物力學(xué)的測(cè)試:首先逐條測(cè)量鞏膜條帶的厚度，測(cè)量?jī)x器由力學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，測(cè)量3次，取均值，所有測(cè)量由同一人完成，之后將鞏膜條帶用夾具固定好兩端，微調(diào)夾具，使試件松緊適度，并實(shí)時(shí)觀察拉力情況，以靜止時(shí)拉力為-0.5～+0.5 N為標(biāo)準(zhǔn)，然后測(cè)量固定好的鞏膜條帶長(zhǎng)度并按照編號(hào)記錄，使用INSTRON 5544型萬能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行力學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)程序順序?yàn)槿渥儗?shí)驗(yàn)，預(yù)拉伸實(shí)驗(yàn)，拉伸強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)、拉伸破壞實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)期間保持鞏膜條帶濕潤(rùn)，之后計(jì)算出試件彈性模量、蠕變率、極限應(yīng)力和極限應(yīng)變。

2 結(jié)果

2.1 鞏膜厚度 實(shí)驗(yàn)后5組鞏膜厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別鞏膜厚度(mm)羥甲基甘氨酸鈉0.30±0.04重氮咪唑烷基脲0.29±0.07惡唑烷 0.32±0.03京尼平組 0.31±0.05空白對(duì)照組 0.30±0.03F值1.375P值0.249

2.2 極限應(yīng)力 4個(gè)試驗(yàn)組的極限應(yīng)力均較空白組增大，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中羥甲基甘氨酸鈉表現(xiàn)出最強(qiáng)的交聯(lián)能力，極限應(yīng)力增強(qiáng)最明顯為(1.33±0.50)MPa，為空白對(duì)照組的2.18倍。其次表現(xiàn)較好的為重氮咪唑烷基脲組和惡唑烷組。表現(xiàn)最差的京尼平組。三種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)與京尼平相比較增強(qiáng)極限應(yīng)力的能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)ARs更強(qiáng)效。見表4，圖1。

組別極限應(yīng)力(MPa)羥甲基甘氨酸鈉1.33±0.50?#重氮咪唑烷基脲1.28±0.37?#惡唑烷 1.23±0.35?#京尼平組 0.86±0.31?空白對(duì)照組 0.61±0.27F值13.781P值<0.001

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與京尼平組比較，#P<0.05

圖1 試驗(yàn)后不同藥物分組的鞏膜極限應(yīng)力情況

2.3 極限應(yīng)變 4個(gè)試驗(yàn)組極限應(yīng)變均較空白組出現(xiàn)了顯著的降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中重氮咪唑烷基脲組表現(xiàn)出最強(qiáng)的交聯(lián)能力，極限應(yīng)變?yōu)?28.04±7.45)%，較空白對(duì)照組降低了27.05%。其次表現(xiàn)較好的為羥甲基甘氨酸鈉組和惡唑烷組。表現(xiàn)最差的為京尼平組。三種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)與京尼平相比較，重氮咪唑烷基脲組能更顯著的降低極限應(yīng)變(P=0.035)。見表5，圖2。

組別極限應(yīng)變(%)羥甲基甘氨酸鈉30.19±7.91?重氮咪唑烷基脲28.04±7.45?#惡唑烷 29.83±5.55?京尼平組 32.32±5.97?空白對(duì)照組 38.44±4.81F值8.086P值<0.001

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與京尼平組比較，#P<0.05

2.4 彈性模量變化 4個(gè)試驗(yàn)組彈性模量均較空白組出現(xiàn)了增加，其中羥甲基甘氨酸鈉組表現(xiàn)出最強(qiáng)的交聯(lián)能力，彈性模量為(7.70±1.94)MPa，為空白對(duì)照組的2.14倍。其次表現(xiàn)較好的為重氮咪唑烷基脲組和惡唑烷組。表現(xiàn)最差的京尼平組。3種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)與京尼平相比較增強(qiáng)彈性模量的能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)ARs更強(qiáng)效。見表6，圖3。

圖2 試驗(yàn)后不同藥物分組的鞏膜極限應(yīng)變情況

組別彈性模量(MPa)羥甲基甘氨酸鈉7.70±1.94?#重氮咪唑烷基脲7.21±1.84?#惡唑烷 7.15±1.31?#京尼平組 5.00±1.11?空白對(duì)照組 3.60±2.84F值26.459P值<0.001

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與京尼平組比較，#P<0.05

圖3 試驗(yàn)后不同藥物分組的鞏膜彈性模量情況

2.5 蠕變率 4個(gè)試驗(yàn)組蠕變率均較空白組出現(xiàn)了顯著的降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中惡唑烷組的蠕變率最低為(7.69±2.68)%，較空白對(duì)照組降低了34.92%。其次表現(xiàn)較好的為重氮咪唑烷基脲組和羥甲基甘氨酸鈉組。表現(xiàn)最差的為京尼平組。3種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲組、惡唑烷組)與京尼平相比較，惡唑烷組能更顯著的降低極限應(yīng)變(P=0.004)。見表7，圖4。

組別蠕變率(%)羥甲基甘氨酸鈉8.26±3.19?重氮咪唑烷基脲9.12±2.51?惡唑烷 7.69±2.68?#京尼平組 9.36±2.10?空白對(duì)照組 11.82±1.58F值15.388P值<0.001

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與京尼平組比較，#P<0.05

圖4 試驗(yàn)后不同藥物分組的鞏膜蠕變率情況

3 討論

病理性近視的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但已經(jīng)有研究表明病理性近視的發(fā)生發(fā)展與鞏膜的生物力學(xué)下降和鞏膜自身解構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)，從眼球自身解剖來看視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜構(gòu)成了眼球的大部分外殼，從生物力學(xué)性能來看，在相同應(yīng)力的作用下，三層結(jié)構(gòu)切線模量呈數(shù)量級(jí)遞增[15]。在病理性近視的發(fā)展過程中，鞏膜各層生物力學(xué)出現(xiàn)改變表現(xiàn)出顯著下降，當(dāng)鞏膜生物力學(xué)性能下降出現(xiàn)擴(kuò)張的時(shí)候，視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜會(huì)緊跟著出現(xiàn)快速擴(kuò)張，進(jìn)而引起一系列高度近視病變，比如黃斑部新生血管和(或)出血、視網(wǎng)膜(黃斑)劈裂、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜(黃斑)裂孔、后鞏膜葡萄腫等，進(jìn)而引起視功能的明顯損害[16]。遺憾的是目前臨床上尚無公認(rèn)有效地治療或控制病理性近視發(fā)生發(fā)展的手段，應(yīng)用相對(duì)廣泛的是后鞏膜加固術(shù)[17,18]，其可以保持或提高患者最佳矯正視力、阻止或延緩眼軸進(jìn)一步增長(zhǎng)[19]，但長(zhǎng)期效果、手術(shù)方法、加固材料選擇方面尚存爭(zhēng)議[20]。有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)了部分與病理性近視有關(guān)的基因[21,22]，如PAX6基因、LUM基因、IGF基因、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、rs2536等30多個(gè)位點(diǎn)基因，但距離臨床應(yīng)用仍待時(shí)日，所以探索新的治療方法迫在眉睫。

鞏膜膠原交聯(lián)是近年的一個(gè)研究概念，這是受到核黃素-紫外光A角膜膠原交聯(lián)手術(shù)治療圓錐角膜所啟發(fā)。鞏膜交聯(lián)治療病理性近視的原理是通過物理或者化學(xué)方法增強(qiáng)鞏膜的生物力學(xué)強(qiáng)度，進(jìn)而緩解鞏膜擴(kuò)展，延緩眼球增長(zhǎng)，進(jìn)而達(dá)到控制病理性近視致盲的目的。本研究就是探討化學(xué)藥物方法的鞏膜交聯(lián)有效性。探討了2類藥物，第一類是甲醛緩釋體類防腐劑(FARs)，其是一類化合物，約有100多種，廣泛應(yīng)用于洗護(hù)用品、紡織等產(chǎn)品中，我們?nèi)粘Ｉ钪袝r(shí)刻都在接觸此類化合物，但未見到其直接致癌的報(bào)道，歐盟對(duì)各種FARs的安全劑量有著較為明確的限定，我們前期通過查閱文獻(xiàn)初步篩選除了5種較為有潛質(zhì)的FARs，第二類是京尼平，京尼平是一類提取自天然植物的化合物，有著良好的安全性。Babar等[23]通過觀察FARs交聯(lián)后鞏膜的熱變性溫度和FARs對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的毒性反應(yīng)認(rèn)為其是強(qiáng)效、低毒性的交聯(lián)劑。本實(shí)驗(yàn)選擇的FARs藥物種類是參照了既往研究[24]，濃度則參考了歐盟理事會(huì)關(guān)于FARs的法令，選擇的是1/10最大允許安全濃度。動(dòng)物模型選擇兔是因?yàn)椋菊n題組具有成熟的幼兔形覺 剝奪模型建立的經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)成年兔標(biāo)本容易獲得，體重易控制，故本文則對(duì)這4種藥物的有效性進(jìn)行了活體兔試驗(yàn)研究。

從本研究結(jié)果看，京尼平和三種FARs藥物(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、惡唑烷)均表現(xiàn)出了明顯的交聯(lián)效應(yīng)，鞏膜的生物力學(xué)的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)了，這包括極限應(yīng)變、極限應(yīng)力、彈性模量和蠕變率4個(gè)方面均有了顯著增強(qiáng)。但要知道這些交聯(lián)藥物的交聯(lián)效果都與濃度正相關(guān)。在1/10最大允許濃度下的四種生物力學(xué)指標(biāo)來看，極限應(yīng)力最多增大2.18倍(羥甲基甘氨酸鈉組)、極限應(yīng)變最多降低27.05%(重氮咪唑烷基脲組)、彈性模量最多增大2.14倍(羥甲基甘氨酸鈉組)、蠕變率最多降低34.92%(惡唑烷組)。京尼平組極限應(yīng)力增大1.41倍，極限應(yīng)變降低16%，彈性模量增大1.39倍，蠕變率降低20.81%。這點(diǎn)與國內(nèi)外學(xué)者既往研究類似。Campbell等[25,26]研究認(rèn)為京尼平鞏膜交聯(lián)可增強(qiáng)鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度60%。Zyablitskaya等[27]發(fā)現(xiàn)羥甲基甘氨酸鈉的鞏膜交聯(lián)效應(yīng)具備明顯的濃度效應(yīng)，400 mmol/L濃度的藥物交聯(lián)強(qiáng)度是40 mmol/L的6倍。除了本實(shí)驗(yàn)研究的化學(xué)藥物鞏膜交聯(lián)，賈冠美[28]開展了核黃素-紫外光A角膜物理膠原交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)使用功率3.0 mW/cm2，波長(zhǎng)370 nm的紫外線燈聯(lián)合0.1%的5-磷酸核黃素，對(duì)兔鞏膜照射20 min的方法，兔鞏膜彈性模量增加了26.31%，極限應(yīng)力增加了12.21%，蠕變率降低了40.47%。Liu等[29]對(duì)豚鼠進(jìn)行了UVA-核黃素鞏膜膠原交聯(lián)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)能顯著增強(qiáng)鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度。

本研究通過對(duì)活體兔后Tenon’s囊下注射羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、惡唑烷和京尼平4種藥物后鞏膜生物力學(xué)參數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，4種藥物均具備較強(qiáng)的鞏膜膠原交聯(lián)效應(yīng)，能夠顯著提高后鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度，具備治療病理性近視的潛能。綜合數(shù)據(jù)來看FARs較京尼平具備更顯著的增強(qiáng)鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度的能力，但因?yàn)榛瘜W(xué)交聯(lián)效應(yīng)與濃度正相關(guān)，所以這可能與不同種類藥品的濃度差異有關(guān)。我們也會(huì)在未來增加安全性相應(yīng)內(nèi)容，最終探索出臨床急需的治療病理性近視可行性的方法，為患者帶來持久的光明。