CME術后DC-CIK聯合奧沙利鉑、卡培他濱治療結腸癌對血清HER2和APE1自身抗體水平的作用

李國華 張成建 艾萬朝 張軍翔

結腸癌是最常見的消化道惡性疾病之一，直腸與乙狀結腸交界處為其常見的發病部位[1]；治療主要包括手術及輔助放化療[2]，但由于其早期癥狀不典型，確診時常常已是中晚期，同時術后轉移及復發率也是影響患者預后的重要因素[3]。完整結腸系膜切除(complete mesocolic excision,CME)手術是結腸癌規范化手術項目，要求完整切除病灶以及最大程度清掃淋巴結，研究表明其可明顯提高結腸癌患者生存率[4]。奧沙利鉑聯合卡培他濱是目前結腸癌的一線化療方案，研究表明其治療結腸直癌療效明確，安全性高[5]。免疫治療是近幾年較為熱門的腫瘤治療新興方法，主要包括細胞免疫治療、腫瘤疫苗及小分子藥物等[6]，其中樹突狀細胞-細胞因子誘導殺傷細胞(dendritic cell-cytokine induced killer,DC-CIK)是通過體外激活腫瘤抗原特異性的DC-CIK免疫細胞，回輸至患者體內發揮抗腫瘤細胞作用[7]。同時，結腸癌的早期診斷及預后判斷對患者生存狀況有重要意義，人類表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)及APE1自身抗體(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 autoantibodies，APE1-AAbs)是近年研究較多的結腸癌診斷因子[8,9]，并與病情程度密切相關。本試驗旨在探討CME術后DC-CIK細胞免疫治療聯合奧沙利鉑、卡培他濱治療結腸癌對血清HER2和APE1自身抗體水平的作用，以明確其臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2014年9月至2016年7月在我院就診的82例結腸癌CME術后患者為研究對象，按隨機數字表法分成對照組(n=41)和試驗組(n=41)。對照組中，男18例，女23例；平均年齡(54.33±6.28)歲；分期：Ⅱ期10例，Ⅲ期31例；病理類型：腺癌28例，粘液癌10例，未分化癌3例。試驗組中，男19例，女22例；平均年齡(55.42±6.19)歲；分期：Ⅱ期9例，Ⅲ期32例；病理類型：腺癌30例，粘液癌9例，未分化癌2例。2組性別比、年齡、分型等一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。2組患者治療由同一組具有結腸癌治療經驗的醫師施行。本研究在試驗前已由醫院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：年齡>18歲；經病理檢查符合結腸癌診斷標準[10]；首次行CME且術前未接受過放化療。

1.2.2 排除標準：結腸癌伴遠處轉移；對化療耐受差；預期壽命<3個月；合并其他腫瘤患者；合并心、肝、腎等系統疾病；對本研究藥物過敏者；拒絕簽署知情同意書。

1.3 治療方法 對照組采用奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫藥公司，規格：100 ml∶0.1 g)劑量130 mg/m2，溶于5%葡萄糖溶液(河南華利藥業有限責任公司，規格：500 ml∶25 g)500 ml中，緩慢靜脈滴注3 h，第1天；卡培他濱片(上海羅氏制藥公司，規格：0.5 g/12片)治療，1 g/m2，口服，早晚各1次，第1～14天，完成1個周期化療(共4周)，完成6個周期治療。試驗組在對照組的基礎上，分別在化療開始前、化療3周及6周期后各行DC-CIK細胞免疫治療1個周期，將制備完成的DC于腹股溝淋巴結處皮下注射，每周期3次共注入(3～5)×108個細胞，同時將制備完成的CIK行靜脈輸注，1次/d，每次完成輸注后行IL-2注射液100萬單位靜脈滴注，每周期5次共輸注5×109個細胞。

1.4 DC-CIK細胞制備方法 (1)患者全腫瘤抗原制備：取患者腫瘤組織標本大小1 cm×1 cm×0.5 cm，取材不可包含壞死及正常組織，慶大霉素溶液沖洗3次后置于8萬U慶大霉素溶液浸泡，-80℃凍存；37℃水浴箱復溫1640培養基沖洗3次后剪碎組織在200目網塞上研磨，1640培養基沖洗留沖洗液-80℃凍存，37℃水浴箱復溫，1 500 r/min離心15 min，留取上清液即為患者全腫瘤抗原，核對患者編號，-80℃凍存備用。(2)DC腫瘤疫苗及CIK制備：予患者注射200 μg 重組人粒細胞刺激因子，24 h后抽取外周血100 ml，肝素管抗凝，Ficoll梯度離心法分離單個核細胞，用1640培養基沖洗3次后將分離所得細胞懸浮于1640培養基中，細胞濃度2×106個/ml，置于37℃、2%CO2培養箱中培養4 h，貼壁細胞即為DC，懸浮細胞即為CIK。將細胞懸浮液吸出作為CIK培養，將DC加入DC培養基培養(含慶大霉素40 U/ml，白細胞介素420 ng/ml，粒單細胞集落刺激因子50 ng/ml)，每48小時換液，培養第6天加入患者全腫瘤抗原及RH-TNF 15 ng/ml，孵育1 d，即得DC腫瘤疫苗，0.9%氯化鈉溶液洗滌，抽取小部分混入CIK培養，剩余配入1%人血白蛋白制成DC腫瘤疫苗(2 ml/支)；CIK培養(含γ-干擾素1 000 U/ml，IL-2 500 U/ml)，37℃、5%CO2培養箱中孵育1 d，加入抗CD3單抗100 μg/ml和IL-15 10 U/ml,每72小時更換培養液，保持細胞濃度2×106個/ml，10 d后取細胞液行流式分析，確認無微生物污染，0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，配入1%人血白蛋白制成DC-CIK細胞液(200 ml/袋)。

1.5 觀察指標

1.5.1 臨床療效：分別于治療前、治療后2周、治療后2年抽取患者3 ml外周靜脈血，賽默飛離心機以3 000 r/min速度離心10 min，取血清冷凍保存待檢(-20℃保存)，使用人CEA酶聯免疫檢測試劑盒(上海信裕公司產，操作嚴格參照說明書)測定CEA數值。治療期間及治療后2年內定期隨訪(包括血常規、腫瘤標志物、結腸鏡、腹部B超及CT，必要時行PET檢測)，評估復發及轉移情況，記錄2組患者2年腫瘤復發率。

1.5.3 血清HER2及APE1-AAbs水平：分別于治療前、治療后2周、治療后2年抽取患者3 ml外周靜脈血，賽默飛離心機以3 000 r/min速度離心10 min，取血清冷凍保存待檢(-20℃保存)，使用HER2酶聯免疫檢測試劑盒(上海仁捷科技有限公司產，操作嚴格參照說明書)，APE1-AAbs酶聯免疫檢測試劑盒(上海江萊生物科技公司產，操作嚴格參照說明書)測定血清HER2及APE1-AAbs水平。

1.5.4 不良反應：記錄治療過程中發生的不良事件，評價治療安全性。

2 結果

2.1 2組患者臨床療效比較 治療前，2組CEA水平差異無統計學意義(P>0.05)；治療后2周，2組CEA水平明顯降低(P<0.05)，試驗組明顯低于對照組(P<0.05)；治療后2年，2組CEA水平較治療后2周明顯升高，且對照組顯著高于試驗組(P<0.05)，且2組間不同時間點及組間時間點交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。治療2年后，試驗組及對照組2年腫瘤復發率分別為9.76%、26.83%，試驗組明顯低于對照組(P<0.05)。見表1、2。

組別CEA治療前治療后2周治療后2年對照組20.71±10.744.27±2.14?10.27±4.73#試驗組21.25±11.093.14±2.10?△5.70±3.52#△組間F=2.320,P=0.020不同時間點F=2.830,P=0.005組間?不同時間點F=3.532,P=0.000

注：與治療前比較，*P<0.05；與治療后2周比較，#P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

表2 2組2年腫瘤復發率比較 n=41，例

2.3 2組患者血清HER2及APE1-AAbs水平比較 治療前，2組患者HER2及APE1-AAbs表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，2組血清HER2及APE1-AAbs水平較治療前均明顯減低，差異有統計學意義(P<0.05)，且試驗組顯著低于對照組(P<0.05)，治療2年后，2組血清HER2及APE1-AAbs水平均較前升高，且對照組顯著高于試驗組(P<0.05)，且2組間不同時間點及組間時間點交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.4 2組患者不良反應情況比較 治療過程中，試驗組出現注射部位皮損2例，發熱5例，均經對癥處理后12 h內出現好轉；2組患者在骨髓抑制、消化道癥狀(如惡心、嘔吐及腹瀉)、外周神經損傷及手足綜合征等不良反應方面呈現明顯差異，且試驗組明顯低于對照組(P<0.05)。見表5。

注：與治療前比較，*P<0.05；與治療后2周比較，#P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

組別HER2(mg/L)治療前治療后2周治療后2年APE1-AAbs(ng/L)治療前治療后2周治療后2年對照組20.46±4.678.82±3.27?14.32±8.13#10.87±2.706.37±2.18?9.54±8.17#試驗組18.78±4.825.27±4.15?△7.79±5.28#△11.12±3.044.72±2.53?△5.70±6.22#△組間F=9.350,P=0.000F=11.470,P=0.000不同時間點F=5.970,P=0.000F=7.030,P=0.000組間?不同時間點F=7.430,P=0.000F=9.400,P=0.000

注：與治療前比較，*P<0.05；與治療后2周比較，#P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

表5 2組不良反應率比較 n=41，例(%)

3 討論

結腸癌主要病理類型包括腺癌、粘液腺癌及未分化癌等，中晚期結腸癌治療難度大，存在對化療不敏感情況，術后易復發轉移[11]。DC-CIK免疫治療是近幾年腫瘤治療方面的熱點，通過調節腫瘤免疫機制產生抗腫瘤作用，研究表明其在結腸癌輔助治療中可提高患者免疫功能[12]。在結腸癌早期診及病情判斷方面研究也不斷深入[13]，HER2及APE1-AAbs是與腫瘤免疫相關的因子，研究表明其與結腸癌病情預后相關[14]。本試驗旨在探究CME術后 DC-CIK細胞免疫治療聯合奧沙利鉑、卡培他濱對結腸癌血清HER2和APE1-AAbs水平的作用，以明確其臨床應用價值。

HER2屬于酪氨酸激酶活性蛋白，與細胞增殖分化、血管生成等過程密切相關，研究證明其高表達導致細胞增殖分化失控，促進細胞惡性轉化及腫瘤轉移，研究發現HER2可作為多種腫瘤如結腸癌的診斷及預后評價指標[8]。APE1是一種DNA損傷修復蛋白，參與DNA損傷修復及多種轉錄因子如P53等的調控；結腸癌患者APE1異常表達刺激機體產生APE1-AAbs，APE1-AAbs可作為結腸癌輔助診斷因子[19]。本試驗結果表明，治療2周后，2組血清HER2及APE1-AAbs水平較治療前均明顯減低，差異有統計學意義(P<0.05)，且試驗組顯著低于對照組(P<0.05)，治療2年后，2組血清HER2及APE1-AAbs水平均較前升高，且對照組顯著高于試驗組(P<0.05)；分析其可能原因，DC-CIK細胞免疫治療聯合奧沙利鉑、卡培他濱治療采用一線化療方案與DC-CIK免疫治療聯合，可在化療方案控制腫瘤病情基礎上引入免疫細胞，增強患者免疫功能，調節患者腫瘤免疫失衡狀態，試驗結果表明治療后負性Treg細胞對照組明顯高于試驗組，DC-CIK細胞免疫治療調節了腫瘤組織抑制的免疫微環境，發揮更好的抗腫瘤作用，降低了腫瘤負荷，降低了降低結腸癌患者的血清HER2和血清APE1自身抗體水平。王鐵等[20]研究表明，DC-CIK細胞免疫治療聯合奧沙利鉑、卡培他濱治療結腸癌可降低CEA水平，控制腫瘤復發并調節腫瘤免疫，改善患者生存狀態，結果與本研究相符。

在藥物安全性及不良反應方面，試驗組在骨髓抑制、消化道癥狀(如惡心、嘔吐及腹瀉)、外周神經損傷及手足綜合征等不良反應方面呈現明顯明顯低于對照組，說明DC-CIK細胞免疫治療聯合奧沙利鉑、卡培他濱治療在結腸癌治療中安全性好，耐受度較好。

綜上所述，CME術后 DC-CIK細胞免疫治療聯合奧沙利鉑、卡培他濱可提高結腸癌患者的療效，改善機體免疫功能,降低結腸癌患者的血清HER2和APE1-AAbs水平。