Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化杜仲籽油提取工藝及脂肪酸組成分析*

趙惠茹，曹靜思，高 建，靖 會(huì)，李璐瑤

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

杜仲為杜仲科植物杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)的干燥樹(shù)皮，具有補(bǔ)肝強(qiáng)腎、強(qiáng)筋健骨、調(diào)理沖任、固經(jīng)安胎等功效[1-2]。杜仲籽為杜仲的翅果籽，杜仲籽油營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有桃葉珊瑚苷、綠原酸、多聚環(huán)烯醚萜苷、脂肪酸等多種成分[3-5]，具有和杜仲類(lèi)似的功效，主要用于防治腰脊酸疼，風(fēng)濕痹痛，胎動(dòng)不安，習(xí)慣性流產(chǎn)等，還可清除體內(nèi)垃圾，加強(qiáng)人體細(xì)胞生理代謝，防止骨骼老化，平衡人體血壓，是一種很好的功能食品，同時(shí)也是生產(chǎn)其他功能食品的良好基料[6-7]。現(xiàn)階段人們多注重于杜仲皮和杜仲葉的研究開(kāi)發(fā)，對(duì)杜仲籽油的開(kāi)發(fā)利用較少[8-11]。常采用亞臨界流體萃取、水酶法提取或者以石油醚、正己烷為溶劑，超聲波輔助提取，單因素或正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化杜仲籽油提取工藝，雖有簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，但精度不高，預(yù)測(cè)性較差[12-17]。因此，作者采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)杜仲籽油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)其脂肪酸成分進(jìn)行分析，以期為杜仲籽油的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

杜仲籽：產(chǎn)自河北省青縣流河鎮(zhèn)純豐蔬菜良種繁育場(chǎng)，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院邊軍昌老師鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的翅果籽；水為超純水；其他試劑：均為分析純，市售。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A/5975C，美國(guó)Agilent公司；粉碎機(jī)：CS-700，山東鼎坤機(jī)械有限公司；電子精密天平：FA1004B，上海越平科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240B，上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司；智能數(shù)顯恒溫水浴箱：DZKW-D-2，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；超聲波清洗器：KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52，上海亞榮生物儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；425 μm標(biāo)準(zhǔn)篩：上海豐行篩網(wǎng)制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杜仲籽油的提取

稱(chēng)取杜仲籽粉末10 g，以石油醚(60～90 ℃)為提取溶劑，提取溶劑與杜仲籽粉末按照一定的體積質(zhì)量比(mL/g，以下簡(jiǎn)稱(chēng)液料比)、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行回流提取，抽濾后減壓蒸餾去除溶劑，60 ℃下干燥至質(zhì)量恒定得到杜仲籽油，按照提取率=m(杜仲籽油)/m(杜仲籽粉)×100%計(jì)算杜仲籽油出油率。

1.2.2 杜仲籽油的GC-MS分析條件

GC條件：HP-5MS 氣相色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣；程序升溫起始溫度50 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min 的速度升溫到150 ℃，保持10 min，然后以1 ℃/min 的速度升溫到180 ℃，保持10 min，最后以2 ℃/min的速度升溫到220 ℃，保持19 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μL，以分流比20∶1分流進(jìn)樣；柱流量1 mL/min；溶劑延遲3 min。

MS條件：EI 離子源，全掃描方式，接口溫度 250 ℃，離子源溫度 230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，電離能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍(m/z) 45～450，NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)。

1.2.3 脂肪酸的甲酯化及組成分析

精密稱(chēng)取0.1 g杜仲籽油于25 mL圓底燒瓶中，加入2 mL丙酮溶劑使之溶解，再加1 mL甲醇溶液和0.1 mL濃硫酸溶液，置于70 ℃恒溫水浴箱中連續(xù)回流1 h。待冷卻后加入正己烷5 mL，并加蒸餾水5 mL，振蕩使分散均勻，取上清液，再用5 mL正己烷洗滌1次，合并上清液，加入足量的無(wú)水硫酸鈉，靜置12 h充分干燥，取上清液，通過(guò)0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾，取濾液1 mL按GC-MS條件分析脂肪酸組成。質(zhì)譜圖經(jīng)解析并與NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)對(duì)照后確定脂肪酸化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用峰面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸的相對(duì)含量。

1.2.4 杜仲籽油提取工藝優(yōu)化

為了考察提取溫度、提取時(shí)間、液料比對(duì)杜仲籽出油率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)杜仲籽出油率的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 杜仲籽油提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)杜仲籽出油率的影響

稱(chēng)取杜仲籽粗粉5 g共5份，分別以液料比4、8、12、16、20 mL/g加入石油醚(60～90 ℃)，在水浴溫度為50 ℃條件下提取150 min，按照1.2.1方法計(jì)算杜仲籽出油率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

液料比/(mL·g-1)圖1 液料比對(duì)杜仲籽出油率的影響

由圖1可知，當(dāng)液料比由4 mL/g增加至8 mL/g時(shí)，出油量增長(zhǎng)速度較快，繼續(xù)增加至液料比至20 mL/g，出油量增長(zhǎng)不明顯。兼顧經(jīng)濟(jì)效益節(jié)約溶劑的情況，確定液料比為8 mL/g繼續(xù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察。

2.1.2 提取溫度對(duì)杜仲籽出油率的影響

稱(chēng)取杜仲籽粗粉5 g共5份，以液料比8 mL/g加入石油醚(60～90 ℃)，分別在20、35、50、65、80 ℃水浴溫度下提取150 min，按照1.2.1方法計(jì)算杜仲籽出油率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

t/℃圖2 提取溫度對(duì)杜仲籽出油率的影響

由圖2可知，隨著提取溫度的升高傳質(zhì)加快，出油率不斷增大，t=20～50 ℃出油率增長(zhǎng)較快，t>50 ℃后出油率增長(zhǎng)不顯著，故在進(jìn)行之后的提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，考慮到溫度太高可能會(huì)使杜仲膠溶出增大，確定50 ℃為提取溫度繼續(xù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)杜仲籽出油率的影響

稱(chēng)取杜仲籽粗粉5 g共5份，以液料比8 mL/g加入石油醚(60～90 ℃)，在50 ℃水浴溫度下分別提取60、90、120、150、180 min，按照1.2.1方法計(jì)算杜仲籽出油率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

t/min圖3 提取時(shí)間對(duì)杜仲籽出油率的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，出油率不斷增大。這是由于在提取初期，原料中油脂含量較高，在溶劑中溶解較快，出油量迅速增加，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，原料中油脂含量減少，油脂在溶劑中的飽和度越來(lái)越大，因而在溶劑中溶解減慢，出油量增加相應(yīng)趨緩。

2.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇各因素的最佳取值范圍。以杜仲籽出油率為考察指標(biāo)，液料比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)為實(shí)驗(yàn)因素，各水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，效應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表1 因素各水平的代碼值和實(shí)際操作物理量

表2 效應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

根據(jù)二次回歸方程中兩兩因素對(duì)杜仲籽出油率的影響，分別繪制各個(gè)因素的三維效應(yīng)面圖見(jiàn)圖4～圖6。

由圖4～圖6可知，兩兩因素交互作用對(duì)杜仲籽出油率的影響趨勢(shì)均較平緩，作用不顯著，這與回歸模型方差分析中的顯著性一致。

圖4 液料比和提取溫度對(duì)杜仲籽出油率的影響

圖5 液料比和提取時(shí)間對(duì)杜仲籽出油率的影響

圖6 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)杜仲籽出油率的影響

由Design Expert 8.0.6軟件分析得最佳提取工藝為液料比14 mL/g，提取溫度35 ℃，提取時(shí)間90 min。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，根據(jù)優(yōu)化出的最佳提取工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平行做3份，杜仲籽平均出油率為10.96%(RSD為4.82%)，預(yù)測(cè)值為10.03%，結(jié)果表明工藝穩(wěn)定可靠。

2.3 杜仲籽油的脂肪酸成分分析

應(yīng)用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)杜仲籽油脂肪酸組成進(jìn)行定性和定量分析，經(jīng)譜庫(kù)檢索和質(zhì)譜圖解析，見(jiàn)圖7。

t/min圖7 杜仲籽油脂肪酸成分的總離子流圖

由圖7可知，杜仲籽油主要由亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸和硬脂酸等脂肪酸組成，其保留時(shí)間分別為12.34、13.90、14.97、15.48和16.78 min，相對(duì)含量分別為10.54%、13.89%、5.52%、61.73%、2.17%，杜仲籽油中具有較高食用價(jià)值和保健作用的不飽和脂肪酸含量高達(dá)88.34%。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化杜仲籽油提取工藝為藥材與提取溶劑石油醚(60～90 ℃)液料比14 mL/g，提取溫度35 ℃，提取時(shí)間90 min，影響杜仲籽油提取率因素的主次順序依次為液料比>提取溫度>提取時(shí)間。在此工藝條件下，杜仲籽出油率為10.96%，實(shí)驗(yàn)精度高，重現(xiàn)性好。GC-MS分析其脂肪酸主要為不飽和脂肪酸，且含量最高的為亞麻酸，可達(dá)61.73%，有一些出峰明顯但不屬于脂肪酸的成分經(jīng)過(guò)對(duì)比后初步鑒定為苯丙素類(lèi)、木質(zhì)素類(lèi)以及黃酮類(lèi)等成分，具體結(jié)構(gòu)的確認(rèn)有待于進(jìn)一步研究。