miR-132和MMP-16在乳腺癌患者血清中的表達及臨床意義

孫勇 鹿彬 張鵬

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，但是其死亡率隨著醫學技術的發展有大幅度的降低，然而其發生率卻在不斷地上升[1]。基質金屬蛋白酶-16(matrix metalloprote inase 16，MMP-16)是一種作用于講解細胞外基質和基底膜部分成分的基質金屬蛋白酶，從而參與腫瘤的發生與發展[2]。而微小核糖核酸(micro RNA，miR)是一類內源的、長約22 nt的非編碼RNA[3]。目前在人體內發現了約千種miR，研究表明，部分的miRNA在人體的免疫反應過程中起著重要的調控作用[4]。目前對于其在淋巴結轉移以及預后方面并沒有一個很好的檢測指標，仍然需要大量的臨床試驗來進一步的找出適合其的檢測指標[5]。基于以上依據，本研究以我院經臨床診斷收治的93例乳腺腫瘤患者與43例健康受試者為研究對象，探討miR-132和MMP-16在乳腺癌患者血清中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2017年1月至2018年9月經臨床診斷收治的93例乳腺腫瘤患者納入病例組，根據醫學影像學資料以及病理活檢等檢查分為乳腺良性腫瘤組(31例)和乳腺癌組(62例)。病例組患者，男48例，女45例；年齡27～70歲；體重指數18.47～26.82 kg/m2；腰臀比0.65～0.97；另選取我院同期行健康體檢的43例正常受試者納入正常組，其中受試者年齡29～68歲；體重指數18.16～26.27 kg/m2；腰臀比0.67～0.94。2組受試者性別比、年齡、體重指數及腰臀比等一般資料間差異無統計學意義(P>0.05)，具有良好的可比性。見表1。

組別年齡(歲)BMI(kg/m2)WHR性別(例)男/女正常組(n=43)48.43±11.6223.74±2.710.86±0.2024/19病例組 乳腺良性腫瘤(n=31)49.52±10.5423.83±2.460.83±0.1916/15 乳腺癌(n=62)47.48±12.3523.84±2.570.84±0.2132/30 F值0.1610.1220.0320.541 P值0.8510.8870.9700.764

注：WHR=WC/HIP；BMI=體重/身高2

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合乳腺癌的診斷標準[6]的患者；②意識清晰，可以良好配合實驗的患者；③知情同意并簽署自愿參與本次研究相關文件的患者。

1.2.2 排除標準：①有嚴重肝、腎功能不全或其他嚴重器質性疾病的患者；②存在嚴重免疫系統疾病或者內分泌系統疾病的患者；③近3個月使用了激素類藥物的患者；④既往有高血壓、糖尿病、甲狀腺相關疾病等內分泌系統疾病的患者。

1.3 指標測定

1.3.1 受試者血清標本的采集和總RNA的提取：①所有受試者穿著貼身衣物、脫去鞋子測量凈身體重和身高；②保證清晨空腹，次日早晨約8∶00時抽取肘靜脈2 ml靜脈血置于3.2%枸緣酸鈉1∶9真空抗凝管中，放入離心機，在4℃、4 000 r/min下離心15 min后放入空試管中；③用TRlzol試劑將miR從血漿中分離；④將提取的miR使用miR cDNA第一鏈合成試劑反轉錄成單鏈cDNA；⑤應用SYBR Green實時熒光技術定量檢測血清miR-132。

1.3.2 檢測血清miR-132的表達水平[7]：①所有受試者均保證清晨空腹，次日早晨約8∶00時抽取肘靜脈2 ml 靜脈血，加入Trizol試劑按1∶5的比例混合后置于-81℃冷凍箱保存；②取其中1 ml全血提取RNA，測試其濃度和純度后進行反轉錄；③取1 μl RNA作為反轉錄模板，配置反轉錄反應體系，總體積共20 μl(其中包括2×mi RNA q PCR Mix 10 μl；正向引物0.4 μl，濃度10 μmol/L；反向引物0.4 μl，濃度10 μmol/L；剩余體積用雙蒸水補齊)，合成cDNA收集備用；④采用熒光定量PCR儀器進行試驗，反應條件為94℃預變性3 min、94℃下20 s、58℃下20 s、72℃下40 s，共40個循環，每組試驗均以U6為內參；⑤使用2-ΔΔCt計算mi RNA表達量用相對定量;⑥反應體系中所用的引物。見表1。

表1 反應體系中所用的引物

1.3.3 血清MMP-16水平測定[8]:所有受試者清晨空腹，次日早晨約8∶00時抽取肘靜脈3 ml靜脈血，放入離心機中分離血清，并且在24 h內進行檢測，采用酶聯免疫吸附實驗(EKISA)檢測血清MMP-16水平。

2 結果

2.1 3組患者血清miR-132和MMP-16表達比較 病例組患者血清miR-132水平明顯低于正常組，且乳腺癌組明顯低于乳腺良性腫瘤組(P<0.05)；病例組患者血清MMP-16水平明顯高于正常組，且乳腺癌組明顯高于乳腺良性腫瘤組(P<0.05)。見表2。

2.2 乳腺癌患者血清miR-132和MMP-16與臨床指標的關系 血清miR-132和MMP-16表達與年齡、腫瘤臨床TNM分期、淋巴結的轉移以及腫瘤大小相關(P<0.05)；血清miR-132和MMP-16表達與病理分級和免疫組化無關(P>0.05)。見表3、4。

組別miR-132MMP-16正常組(n=43)1.01±0.1173.12±16.31病例組 乳腺良性腫瘤組(n=31)0.80±0.4595.14±19.25 乳腺癌組(n=62)0.41±0.24?#132.43±49.12?# F值6.6536.171 P值0.0020.005

注：與正常組比較,*P<0.05；與乳腺良性腫瘤組比較,#P<0.05

項目miR-132t(F)值P值年齡(歲) <48(n=34)0.49±0.2810.2570.001 ≥48(n=28)0.38±0.21臨床TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期(n=22)0.53±0.3122.123<0.001 Ⅲ～Ⅳ期(n=40)0.35±0.19病理分級 Ⅰ～Ⅱ期(n=23)0.43±0.260.5410.764 Ⅲ～Ⅳ期(n=39)0.43±0.25淋巴結的轉移 無轉移(n=30)0.55±0.328.7590.013 存在轉移(n=32)0.34±0.18腫瘤大小(mm) PT≤20(n=20)0.52±0.2012.1150.001 20﹤PT≤50(n=33)0.45±0.16 PT>50(n=9)0.35±0.09免疫組化 ER +(n=35)0.44±0.260.8150.419 -(n=27)0.39±0.21 PR +(n=29)0.44±0.250.6850.496 -(n=33)0.40±0.21

注：PT=原發性腫瘤的最大直徑

2.3 血清miR-132和MMP-16水平診斷乳腺癌結果評價 以臨床診斷乳腺癌為診斷標準，以血清miR-132和MMP-16水平為評價指標對所有受試者繪制ROC曲線，分析區分乳腺浸潤性癌和乳腺良性腫瘤的最佳臨界值。當血清MMP-16水平取值為133.63 ng/ml時，靈敏度為0.657，特異度為0.784，ROC曲線下面積為0.741(95% cl：0.632～0.848)。當血清miR-132水平取值為0.44ng/ml時，靈敏度為0.661，特異度為0.790，ROC曲線下面積為0.752(95% cl：0.639～0.857)。以上述為標準，乳腺癌Ⅰ～Ⅳ期血清miR-132異常率分別為77.86%、53.84%、90.87%、100%；乳腺癌Ⅰ～Ⅳ期血清MMP-16異常率分別為78.09%、54.13%、91.04%、100%。見圖1、2。

3 討論

基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloprote inases，MMPS)是一類以來鋅離子的內肽酶，而MMP-16是一種能降解許多種膠原(包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原)以及纖維粘連蛋白等基膜或者外基質組成成分的明膠[9]。有研究表明，血清MMP-16對Ⅳ型膠原的降解可以加速惡性腫瘤的浸潤和轉移，為其開辟了良好的轉移、浸潤通道；而血清miR-132在類風濕關節炎以及骨性關節炎患者的血清表達重降低，提示其可能在自身免疫系統當中發揮著不可或缺的作用[10，11]。另有研究發現，血清miR-132可以阻斷某些特定的蛋白激酶(protein linase，PK)的信號通路，從而起到抑制癌細胞增殖和聚集形成的作用[12]。

項目MMP-16t(F)值P值年齡(歲) <48(n=34)131.36±34.1710.2570.001 ≥48(n=28)137.26±39.09臨床TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期(n=22)106.74±29.6122.123<0.001 Ⅲ～Ⅳ期(n=40)144.24±40.48病理分級 Ⅰ～Ⅱ期(n=23)113.64±32.560.5410.764 Ⅲ～Ⅳ期(n=39)139.65±36.23淋巴結的轉移 無轉移(n=30)118.36±37.628.7590.013 存在轉移(n=32)146.29±39.43腫瘤大小(mm) PT≤20(n=20)116.68±33.2811.8390.001 20﹤PT≤50(n=33)135.61±37.24 PT>50(n=9)141.26±38.81免疫組化 ER +(n=35)133.25±41.510.2820.886 -(n=27)130.19±46.63 PR +(n=29)133.57±41.920.2580.773 -(n=33)131.83±44.37

注：PT=原發性腫瘤的最大直徑

圖1 血清miR-132水平診斷乳腺癌結果ROC曲線

圖2 血清MMP-16水平診斷乳腺癌結果ROC曲線

本實驗應用SYBR Green實時熒光技術定量檢測血清miR-132水平。采用酶聯免疫吸附實驗(EKISA)檢測血清MMP-16水平。比較3組患者血清miR-132和MMP-16表達、乳腺癌患者血清miR-132和MMP-16與臨床指標的關系以及血清miR-132和MMP-16水平診斷乳腺癌結果評價來探討miR-132和MMP-16在乳腺癌患者血清中的表達及臨床意義。結果顯示病例組患者血清miR-132水平明顯低于正常組，且乳腺癌組明顯低于乳腺良性腫瘤組(P<0.05)；病例組患者血清MMP-16水平明顯高于正常組，且乳腺癌組明顯高于乳腺良性腫瘤組(P<0.05)。其原因在于乳腺癌的形成原因十分的復雜，其與遺傳、感染、激素以及免疫功能等各個方面的因素都有著或多或少的關系，而目前對于血清miR-132在乳腺癌疾病方面的研究并不常見，其可以通過調節轉錄因子中的信號傳導的表達對信號通路起著負調節的作用[13,14]。本次實驗結果顯示血清miR-132和MMP-16表達與年齡、腫瘤臨床TNM分期、淋巴結的轉移以及腫瘤大小相關(P<0.05)；血清miR-132和MMP-16表達與病理分級和免疫組化無關(P>0.05)。提示血清miR-132和MMP-16表達與患者病情的發展、淋巴結的轉移以及各方面的預后密切相關[15]。有研究顯示血清miR-132是神經元的正常分化、成熟以及功能形成所必需的因子之一，在許多的癌癥疾病中可見其的表達降低[16]。本次實驗結果顯示乳腺癌Ⅰ～Ⅳ期血清miR-132異常率分別為77.86%、53.84%、90.87%、100%；乳腺癌Ⅰ～Ⅳ期血清MMP-16異常率分別為78.09%、54.13%、91.04%、100%。有研究表明血清MMP-16的上升與淋巴結的轉移相關，且其血清水平可以反應腫瘤細胞的增殖分化情況[17]。且本研究發現，當血清MMP-16水平取值為133.63 ng/ml時，靈敏度為0.657，特異度為0.784，ROC曲線下面積為0.741(95% cl：0.632～0.848)；當血清miR-132水平取值為0.44 ng/ml時，靈敏度為0.661，特異度為0.790，ROC曲線下面積為0.752(95% cl：0.639～0.857)，提示血清miR-132和MMP-16表達有較好的特異性與靈敏性，其有可能成為判斷乳腺癌是否淋巴結轉移以及預后的生物學新指標[18]。

綜上所述，血清miR-132和MMP-16可以作為乳腺癌的血清觀察指標，對判斷和診治乳腺癌的發生發展以及轉移情況有較好的臨床意義，值得臨床推廣和應用。