去甲斑蝥素誘導黑色素瘤M14細胞凋亡及相關機制的研究

高楊 叢力寧 程毅 劉巖

黑色素瘤是一種好發于皮膚的高度惡性的腫瘤，有易發生轉移，病死率高，預后差[1,2]等特點，且缺乏較有效的治療手段。斑蝥素是從斑蝥的干燥蟲體中提取的一種抗腫瘤活性成分，具有抗腫瘤、升白細胞、增強免疫、抗病毒、抑菌及抗氧化等作用，臨床上可用于治療多種腫瘤。去甲斑蝥素是斑蝥素的衍生物，由人工合成，其毒副作用比斑蝥素低，具有獨特的升白細胞作用及較強的抗癌作用。本研究通過去甲斑蝥素作用于人黑色素瘤M14細胞，觀察去甲斑蝥素對M14細胞凋亡和有關凋亡基因及細胞內活性氧(ROS)的影響，探討其可能的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人M14黑素瘤細胞株，購于中國科學院上海細胞研究所；去甲斑蝥素購于美國Sigma 公司，1640培養基購于美國Gibco公司，CCK8試劑購于日本同仁化學研究所，Trizol試劑購于Invitrogen公司、高效RIPA裂解液購于北京索萊寶來生物技術有限公司，PCR引物購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司，活性氧檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司，丙二醛(MDA)檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：M14細胞培養于10%胎牛血清的1640培養基，37℃，5%CO2的恒溫培養箱中。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態和生長狀態，待細胞融合達到90%以上時，按1∶2或1∶3的比例進行傳代。將細胞分為空白對照組和50、100、500 μg/L去甲斑蝥素給藥組。

1.2.2 CCK8檢測：細胞活性將對數生長期的M14細胞接種于96 孔板中，每孔5×103個細胞，每組設5個平行孔，待細胞貼壁后，棄去原培養液，實驗組每孔加入100 μl的藥物，濃度分別為0、50、100、500 μg/L，只加培養基無細胞孔為空白對照組。分別作用12、24 h后，加CCK8每孔10 μl作用2 h，用酶標儀測定每孔450 nm波長的吸光度值并計算抑制率。生長抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%。

1.2.3 qRT-PCR法檢測凋亡相關mRNA的表達

1.2.3.1 Trizol法提取細胞總RNA：貼壁細胞PBS洗滌3次，加入1 ml Trizol，吹打充分混勻，移至EP管，冰盒靜置5 min，加入0.2 ml氯仿，上下劇烈震蕩15 s，冰盒靜置5 min，2 min，4℃離心，12 000 r/min×15 min，取上層水相移入一新無RNase管中，加入等體積異丙醇，冰盒靜置10 min，4℃離心，12 000 r/min×10 min。棄上清，管中白色沉淀即RNA，去除殘液后加入0.4 ml 75%乙醇洗滌，4℃離心，9 000 r/min×5 min，棄上清，晾干RNA。加入40 μl ddH2O溶解，吹打混勻，-80℃保存。

1.2.3.2 總RNA質量的檢測:測定RNA樣品的OD260及OD280，計算RNA的濃度，以OD260/OD280，保證其比值在1.9～2.0，若偏差過大，則表示RNA有污染，判斷RNA樣品中有無蛋白質或者有機溶劑污染。

1.2.3.3 RNA反轉錄成cDNA。見表1。

表1 RNA反轉錄成cDNA反應體系

1.2.3.4 qRT-PCR GAPDH為內參，每個樣品設3個復孔，總體積為20 μl。充分混勻，操作IQ5軟件：熱學過程：95℃×5 min，95℃×15 s，58℃×30 s，72℃×30 s，共40個重復循環，采集PCR產物熒光值。結束后，設置溶解曲線程序：95℃×15 s，60℃～95℃，緩慢升溫，產生熔點曲線或稱解離曲線。設閾值，檢測mRNA的表達情況。見表2。

表2 qRT-PCR GAPDH為內參反應體系

1.2.3.5 引物序列:見表3。

表3 引物序列

1.2.4 雙重加熱法檢測MDA的水平。其實驗原理基于硫代巴比妥(TBA)和MDA反應產生的紫色，通過比色法間接測定MDA的水平。調整M14細胞濃度為1.0×105個，接種于6孔板，37℃、5% CO2溫箱中孵育過夜。加入不同濃度的去甲斑蝥素后孵育24 h后離心收集細胞。加入200 μl細胞裂解液充分裂解后,1 600 r/min離心10 min取上清，按照試劑盒的操作說明，加入TBA溶液，95℃煮沸40 min。樣品迅速冷卻至室溫，并按要求加入96孔板中，在532 nm酶標儀測定吸光光度值。MDA含量為每毫克蛋白質中的納摩爾數。

1.2.5 細胞內ROS水平檢測：DCFH-DA被自由基(H2O2)去乙酰化轉變為其熒光產物DCF，通過檢測DCF的熒光值，可間接檢測細胞內ROS的水平。調整M14細胞濃度為1.0×105個，接種于6孔板，37℃、5% CO2溫箱中孵育過夜。加入不同濃度的去甲斑蝥素后孵育24 h后收集細胞。按照活性氧檢測試劑盒的操作說明，用DCFH-DA 熒光探針標記細胞，利用熒光酶標儀在488 nm激發波長、525 nm發射波長下測定不同組別中DCF 的熒光值。

2 結果

2.1 去甲斑蝥素抑制M14細胞增殖 CCK8結果所示，去甲斑蝥素可抑制黑素瘤M14細胞的增殖，藥物作用24 h后各組的細胞生長抑制率比較有顯著差異(F=135.76，P<0.05)，作用48 h后亦有顯著差異(F=96.12，P<0.05)，經兩兩比較，各濃度去甲斑蝥素與陰性對照組組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

組別24 h凋亡率48 h凋亡率對照組 6.34±1.037.86±1.3750 μg/L NCTD 14.57±1.45?18.89±2.13?100 μg/L NCTD38.48±2.67?#46.18±3.06?#500 μg/L NCTD56.72±3.78?#△63.57±3.64?#△

注：與對照組比較，*P<0.05；與50 μg/L NCTD比較，#P<0.05；與100 μg/L NCTD比較，△P<0.05

2.2 去甲斑蝥素對凋亡相關基因的影響 采用RT-PCR法檢測去甲斑蝥素對人M14黑色素瘤細胞中凋亡基因mRNA的影響。去甲斑蝥素作用M14細胞24、48 h后，均能夠升高凋亡相關基因Bax、caspase-3、caspase-9、細胞色素c的mRNA的表達，減少凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表達(P<0.05)。見表5。

組別Bax相對mRNAcaspase-3相對mRNAcaspase-9相對mRNA細胞色素c相對mRNABcl-2相對mRNA對照組 1111150 μg/L NCTD1.11±0.251.07±0.181.05±0.030.83±0.110.83±0.08100 μg/L NCTD1.32±0.0451.74±0.09#1.34±0.05#1.18±0.06?0.60±0.16#500 μg/L NCTD1.47±0.085?1.74±0.38#1.42±0.04#1.25±0.08#0.40±0.11#

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.3 去甲斑蝥素對M14細胞中ROS的影響經過藥物處理人M14黑色素瘤細胞24 h后，采用熒光探針標記法檢測不同濃度去甲斑蝥素作用在人M14黑色素瘤細胞ROS水平。如圖3顯示結果發現，去甲斑蝥素能明顯的提高細胞內ROS水平(F=22.029，P<0.05)，與對照組對比，各實驗組差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6，圖1。

組別ROS相對含量對照組 150 μg/L NCTD 1.31±0.035?100 μg/L NCTD1.25±0.04?500 μg/L NCTD1.34±0.10?

注：與對照組比較，*P<0.01

圖1 熒光探針法檢測去甲斑蝥素對黑素瘤M14細胞ROS的影響

2.4 去甲斑蝥素對M14細胞中MDA的影響經過不同濃度藥物處理人M14黑色素瘤細胞24 h后，采用雙重加熱法檢測不同濃度去甲斑蝥素作用在人M14黑色素瘤細胞后的MDA水平。去甲斑蝥素能明顯的提高細胞內MDA水平(F=14.230，P<0.05)，且呈劑量依賴性。與對照組相比，100 μg/L、500 μg/L 2組差異有統計學意義(P<0.05)。見表7，圖2。

組別MDA對照組 0.31±0.0450 μg/L NCTD 0.56±0.10100 μg/L NCTD0.88±0.13?500 μg/L NCTD0.99±0.23#

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

圖2 雙重加熱法檢測去甲斑蝥素對黑素瘤M14細胞丙二醛(MDA)的影響

3 討論

去甲斑蝥素(noncantharidin，NCTD)為斑蝥素的衍生物，是人工合成的一種新型抗癌藥物，是一種水溶性合成小分子，與斑蝥素相似，其摩爾質量、復雜度和重原子數分別為168.15 g/mol、246和12。NCTD可以引起多種細胞系的凋亡，目前已有研究表明去甲斑蝥素對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞[1]、骨髓瘤U266細胞[2]、肺腺癌A549細胞[3]、胰腺癌PANC1細胞[4]、胃癌SGC7901細胞[5]、乳腺癌MCF7細胞[6]等均具有抑制作用。此外，它還可以抑制血管的生成和轉移，影響控制細胞增殖的多種途徑。

目前，包括Wnt/β-連環蛋白，Sonic hedgehog(Shh)和Notch信號通路在內的幾種途徑已被確定在癌癥干細胞的自我更新中起到關鍵作用，并可導致腫瘤復發和多藥耐藥，以及血管生成，遷移，侵襲和轉移[7]。去甲斑蝥素可以促進β-catenin活化的喪失并抑制具有顯性β-連環蛋白信號傳導的Jurkat細胞的增殖[8]；NCTD可抑制了乳腺癌各種細胞系的Shh表達[9]；NCTD劑量依賴性地抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞中Akt和NF-κB表達的磷酸化[10]。此外，NCTD在低濃度(0.2～0.8 μg/ml)下使人肺癌A549細胞遷移減少超過65%而不影響細胞活力[11]。細胞外信號調節激酶(ERK)，c-Jun NH2-末端激酶(JNK)的激活和下游轉錄因子NF-κB的調節參與NCTD誘導的人肝癌HepG2細胞凋亡[12]；這表明NCTD具有用活化的Wnt/β-連環蛋白途徑治療癌癥的顯著潛力。在對單一藥物或一類藥物產生耐藥性后，癌細胞對其他功能和結構不相關的藥物表現出交叉耐藥性，導致癌細胞治療失敗，這種現象稱為多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)。盡管目前已研究了MDR的許多機制，但最重要的機制可能是通過細胞膜上藥物轉運蛋白將藥物主動移出從而減少細胞內藥物積累。這些藥物轉運蛋白為ATP結合蛋白，包括p-糖蛋白，多藥耐藥蛋白1、多藥耐藥蛋白2，肺耐藥蛋白、和乳腺癌耐藥蛋白等[7]。NCTD可抑制異質性人上皮結腸直腸腺癌細胞單層模型中p-糖蛋白[13]和多藥耐藥相關蛋白2的表達[14]，誘導對多種化療藥物具有耐藥性的口腔癌細胞的凋亡[15]。在對多柔比星耐藥的人乳腺癌MCF-7R細胞的研究中，NCTD增加了MCF-7R細胞中多柔比星的細胞內積累，并抑制了多藥耐藥蛋白1 mRNA，p-糖蛋白和乳腺癌耐藥蛋白表達的上調[16]?？偟膩碚f，NCTD可能是P-糖蛋白的底物，可能會克服癌細胞的多藥耐藥性。本課題組在前期的實驗研究中，經流式細胞術檢測到去甲斑蝥素對人A375細胞有促進凋亡的作用，本實驗通過CCK8法分析去甲斑蝥素體外作用于人黑色素瘤M14細胞，結果顯示去甲斑蝥素對黑色素瘤細胞具有明顯的生長抑制作用，并且呈時間-劑量依賴性。在前期實驗中，我們還通過DAPI染色法通過熒光顯微鏡下觀察去甲斑蝥素對黑素瘤M14細胞核結構，出現細胞核固縮、核邊集及凋亡小體等細胞凋亡形態學改變，證實去甲斑蝥素對人黑色素瘤M14細胞有抑制作用，但其作用機制尚不明確[17]。在本試驗中，我們研究了去甲斑蝥素是否可以在M14細胞中激活線粒體途徑而誘導細胞凋亡。

細胞凋亡是發生在多細胞生物中的程序性細胞死亡的過程，這個過程包括起泡，細胞收縮，核碎裂，染色質濃縮，染色體DNA片段化和mRNA全面衰變[18]?；诖碳ひ蛩氐牟煌?，細胞凋亡通常通過激活外源性(死亡受體)途徑或內在(線粒體)途徑。內源性途徑通常被來自于細胞內部的壓力激活，由一連串的刺激因素誘導，包括DNA損傷和生長因子減少，這些刺激信號最終觸發線粒體外膜通透性增加(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)。其中線粒體外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)通透性增加一般是由于某些促凋亡BCL-2家族成員激活的結果[19]。Bcl-2家族包括凋亡抑制因子和凋亡促進因子兩大類，凋亡抑制因子包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等，Bax、Bak、Bcl-xS等為凋亡促進因子。Bax與Bcl-2是一對同源或者異源二聚體，當細胞DNA受損時，Bax表達增強，可與Bcl-2形成同源二聚體，拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，從而激活線粒體凋亡通路，引起細胞凋亡。有文獻報道，ROS可作為細胞的第二信使調控細胞增長、促進細胞增殖，但是過高的ROS水平會使細胞因氧化過度而受損，導致細胞凋亡[20]。ROS介導的細胞損傷在早期會引起細胞膜脂質過氧化，同時伴有MDA的產生，因此MDA可間接評價細胞遭受氧化應激損傷的嚴重程度[21]。在前期的研究中，我們通過流式細胞術檢測發現10～40 μmo/L去甲斑蝥素作用在人A375黑色素瘤細胞48 h后，ROS水平明顯有所提高，且呈劑量依賴性。本實驗我們進一步通過熒光探針法檢測去甲斑蝥素對M14黑素瘤細胞ROS的影響，結果顯示去甲斑蝥素同樣可增加M14細胞內的ROS水平。同時，細胞內的MDA水平也升高，間接反映了細胞受到了過度的氧化應激損傷。同時，通過RT-PCR我們還發現，隨著去甲斑蝥素濃度的升高，凋亡相關基因Caspase-3、Capase-9、Bax、細胞色素c基因的mRNA表達量逐漸升高，而凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表達量逐漸降低。綜合以上結果，我們推測去甲斑蝥素可誘導M14細胞凋亡，其作用可能與去甲斑蝥素引發細胞內氧化應激進而啟動線粒體途徑的凋亡通路有關，去甲斑蝥素有望成為治療黑素瘤的有效輔助性藥物。