miR-497調控PlexinA4對鼻咽鱗狀細胞癌侵襲和遷移能力的影響研究

徐志 邢朝暉 徐淑芠 趙臣

鼻咽鱗狀細胞癌是常見的惡性腫瘤之一，具有發病迅速，轉移率高的特點，目前治療鼻咽鱗狀細胞癌的主要手段是手術，但術后復發率較高，且早期癥狀不明顯，患者在就診時往往處于晚期[1]，治愈力低，因此尋找新的靶點成為醫學工作者不斷探尋的課題。有文獻報道鼻咽鱗狀細胞癌的侵襲和癌基因的活化表達相關，因此揭示鼻咽癌相關的基因和調控機制，對控制鼻咽癌轉移具有重要的意義[2]。癌細胞的侵襲能力與細胞內miRNA密切相關，miR-497在多種癌細胞中如肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌中活性受抑制[3-7]，原因可能miR-497通過某些特定的通路起到抑癌基因的作用。PlexinA4作為重要的信號通路，參與到癌細胞的侵襲與轉移過程，有報道稱喉鱗狀癌細胞中miR-497與PlexinA4的表達量呈負相關，而沉默PlexinA4基因，喉鱗狀癌細胞的侵襲率顯著降低[8]。而miR-497和PlexinA4在鼻咽癌鱗狀細胞中的表達及與細胞侵襲能力的研究筆者所見鮮有報道，因此本實驗通過研究miR-497與PlexinA4與在鼻咽癌鱗狀細胞侵襲能力之間的關系，從而為治療鼻咽癌提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2017年1月至2018年12月于我院就診且經病理學確診的鼻咽鱗狀細胞癌患者60例的癌組織及相應癌旁組織，其中男30例，女30例；年齡40～75歲，平均年齡(54.01±6.21)歲；按美國腫瘤研究聯合第七版分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期20例，Ⅲ期30例，Ⅳ期10例；淋巴結分期N0+N1患者38例，N0+N1患者22例。術前患者均未進行放化療。患者及其家屬簽署知情同意書。鼻咽鱗狀細胞HEP-2采購自ATCC細胞庫。

1.2 試劑與儀器 miR-497 mimics和陰性對照(貨號B05009)由上海吉瑪制藥技術有限公司代為合成；qRT-PCR檢測試劑盒、Trizol總RNA 提取試劑盒、Bulge-Loop miRNA、 購自廣東銳博生物科技技術股份有限公司；DMEM細胞培養基購自Hyclone 公司、Promega Dual-Luciferase ReporterAssay System試劑盒、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；青、鏈霉素購自華北制藥有限公司、SYBR Premix Extaq system 購自寶生物工程(大連)有限公司、TRIzol細胞培養箱采購自上海三騰儀器有限公司。各種抗體：PTEN 兔抗 (WB)、PTEN 兔抗 (IHC)、Occludin 兔抗購自美國 santacruz 公司、二抗(IHC)、Actin 鼠抗購自Fermentas 公司。實時熒光定量PCR儀購自應用生物系統公司、恒溫培養箱購自上海譜元儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學檢測PlexinA蛋白表達:將收集的組織樣本固定包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液中進行修復，以充分暴露抗原決定簇。然后用3%的過氧化氫室溫下浸泡10 min，封閉，分別加稀釋好的一抗4℃過夜孵育，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加適量DAB作用2～5 min后用去離子水終止反應，蘇木素復染1.5～2 min，清洗后于梯度乙醇中脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果。由兩位經驗豐富的病理醫師對病理切片進行盲評。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)在光鏡下觀察，用陽性細胞染色強度和陽性細胞比例來判定染色結果。染色強度評分：無顯色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以染色細胞的陽性比例評分<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。上述2項積分相乘，積分0分為陰性(-)，≥1分為陽性。

1.3.2 細胞培養:液氮中取出人鼻咽癌鱗狀細胞株HEP-2，37℃水浴溶解，加入含有10%FBS的DMEM培養基中，離心去上清，加入細胞培養液懸浮細胞，接種于培養瓶中，37℃，5%CO2培養，融合度到80%，采用0.25%的胰蛋白酶消化，采用完全培養基傳代。傳代次數一致且細胞處于對數期用于后續研究。

1.3.3 實時定量PCR檢測miR-497及PlexinA4mRNA的表達:取200 mg癌組織及癌旁組織磨碎，Trizol液與組織處理液混合作用10 min，12 000 r/min離心10 min，去除上層清液，加入Trizol與氯仿震蕩混勻，12 000 r/min 離心20 min，加入異丙醇，用移液器吹打均勻，12 000 r/min離心后，棄去上層清液，留下層絮狀沉淀，加入Trizol與乙醇的混合液，離心棄上清。提取的RNA用DEPC水溶解，按照反轉錄試劑盒反轉錄總的cDNA。按照SYBR方法進行實時定量PCR，并以U6為內參。結果用2-ΔΔCT表示，設計試驗重復。檢測各組基因的表達量。引物miR-497 上游5’-CAGGGTCCGATTCA-3’下游5’-TAGCCGCACACTGTGGT-3’,PlexinA4上游5’-TCTCAGTACAACGTGC-3’上游5’-TAGCACTGGATCGAT-3’。

1.3.4 miR-497過表達細胞系的構建:調整鼻咽鱗狀細胞HEP-2濃度為1×106個/ml，取2 ml接種于6孔板中，培養過夜，采用Lipofectamine2000將濃度均為100 nmol/L的miR-497 mimics和陰性對照轉染至細胞，以空脂質體作為對照。

1.3.5 蛋白免疫印跡檢測PlexinA4蛋白的表達:取轉染48 h細胞，加入適量的RIPA裂解液，裂解30 min，離心，條件為12 000 r/min，4℃ 10 min，收集上清。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100涉世度水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h。加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH作為內參，分析蛋白水平。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因檢測:利用PCR方法構建PlexinA4-wt(野生型PlexinA4-2-3’UTR序列的熒光素酶報告基因質粒)及PlexinA4-mut(突變型PlexinA4-2- 3’UTR序列的熒光素酶報告基因質粒)，將1.3.1中HEP-2癌細胞復蘇，DMEM培養液將癌細胞稀釋到1×105/ml，接種到細胞培養板上，把PlexinA4-wt質粒、PlexinA4-mut質粒、miR-497模擬物和陰性對照轉染分別轉染至相應的HEP-2癌細胞中，37℃、5%CO2培養48 h。檢測各組處理熒光素酶活性。

1.3.7 細胞侵襲實驗:8 μl的Matrigel覆蓋于transwell小室底部，消化液將試驗組及對照組細胞消化，細胞計數，吸取1×105個細胞加入到上室，下室加入細胞培養液，將小室置于細胞培養箱中培養24 h，取出后用無水甲醇固定，用1%的結晶紫染色30 min，PBS沖洗多余染料，放于高倍鏡視野計數穿透細胞數。

1.3.8 細胞遷移實驗:取處于對數期的HEP-2細胞，調整細胞濃度至1×105接種于6孔板，用一次性接種環畫出無細胞區，采用磷酸緩沖液吸取劃痕后脫落的細胞并進行拍照，實驗分為3組：對照組、空白對照組、miR-497過表達組。培養24 h后進行拍照，觀察細胞遷移能力。

2 結果

2.1 miR-497及PlexinA4在鼻咽鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中的表達 免疫組織化學結果顯示PlexinA4在鼻咽鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率為86.67%(52/60)明顯高于癌旁組織中的陽性表達率33.33%(20/60)，差異有統計學意義(χ2=35.556，P=0.000)。qRT-PCR結果也顯示鼻咽鱗狀細胞癌組織中的PlexinA4 mRNA的表達量顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)鼻咽鱗狀細胞癌組織中miR-497的表達量顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1、2，表1、2。

2.2 miR-497過表達細胞系構建 qRT-PCR結果顯示空白對照組和陰性對照組miR-497的表達差異無統計學意義(P>0.05)，過表達組中miR-497的表達量明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，提示成功構建miR-497過表達細胞系。見圖3，表3。

圖1 PlexinA在鼻咽鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中的表達(免疫組織化學×400)

圖2 miR-497及PlexinA4 mRNA在鼻咽鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中的表達

表1 PlexinA在鼻咽鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中的表達 n=60,例(%)

類別miR-497 相對表達量PlexinA4 mRNA相對表達量鼻咽鱗狀細胞癌組織2.43±0.5410.29±1.24癌旁組織 13.07±1.763.21±0.34t值44.76842.653P值0.0000.000

圖3 RT-PCR檢測miR-497在鼻咽癌細胞HEP-2中的表達

表3 RT-PCR檢測miR-497在鼻咽癌細胞HEP-2中的表達

2.3 miR-497過表達對PlexinA4蛋白的影響 Western blot檢測結果顯示miR-497過表達組中PlexinA4的表達明顯低于空白對照組與陰性對照組(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組中PlexinA4的表達量差異無統計學意義(P>0.05)，提示miR-497能夠下調PlexinA4的表達。見圖4，表4。

圖4 miR-497過表達對PlexinA4蛋白的影響

表4 miR-497過表達對PlexinA4蛋白的影響

2.4 雙熒光素酶報告基因檢測結果 雙熒光素酶報告基因檢測轉染miR-497后，PlexinA4-wt(野生型PlexinA4-2-3’UTR序列的熒光素酶報告基因質粒)熒光活性的相對表達量受到顯著抑制(P<0.01)，PlexinA4-mut(突變型PlexinA4-2-3’UTR序列的熒光素酶報告基因質粒)熒光活性的相對表達量沒有變化(P>0.05)。說明miR-497與PlexinA4具有靶向關系。見圖5，表5。

2.5 miR-497對HEP-2侵襲能力的影響 miR-497過表達組穿透細胞數明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.001)，而空白對照組和陰性對照組穿透細胞數差異無統計學意義(P>0.05)，提示miR-497能夠抑制HEP-2的侵襲能力。見圖6，表6。

2.6 miR-497對HEP-2遷移能力的影響 miR-497過表達組HEP-2遷移率明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，而空白對照組和陰性對照組遷移率無統計學意義(P>0.05)，提示miR-497能夠抑制HEP-2的遷移能力。見圖7，表7。

圖5 雙熒光素酶報告基因檢測結果

項目熒光素酶活性相對表達量WtmutCon 0.86±0.090.91±0.15miR-4970.29±0.080.90±0.12t值8.1990.090P值0.0000.932

圖6 miR-497對HEP-2侵襲能力的影響(結晶紫染色×200)

表6 miR-497對HEP-2侵襲能力的影響 n=3,個,

3 討論

鼻咽癌因其發病位置比較隱蔽，不容易檢查，且早期癥狀復雜，缺少明顯的特征，所以往往被忽視，導致診斷和治療延誤。miRNA是通過堿基不完全互補的方式結合于靶基因上，從而影響腫瘤細胞的凋亡、遷徙與轉移，并引發周圍細胞的壞死與凋亡[9]。miR-497位于人類染色體17p13.1上，張蔚等[10]發現miR-497在宮頸癌細胞中表達受抑制，miR-497可以通過下調靶基因HPV-16 E6/E7影響癌細胞侵襲。王娟娟[11]采用RT-PCR檢測發現miR-497在結腸癌組織中的表達明顯低于癌旁組織。管曉翠等[12]研究表明在星形細胞瘤患者癌組織和血清中，miR-497的表達量下降。本研究采用RT-PCR檢測其在鼻咽癌組織和癌旁組織中的表達發現，在鼻咽癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織，提示miR-497在鼻咽癌的發生發展中可能起著重要作用。

圖7 miR-497對HEP-2遷移能力的影響

表7 miR-497對HEP-2遷移能力的影響

為了進一步觀察miR-497在鼻咽癌中的作用，本研究構建了穩定過表達miR-497的細胞系，結果顯示miR-497能夠明顯抑制鼻咽癌細胞HEP-2的侵襲能力和遷移能力。PlexinA4作為神經受體叢素的一員，能夠通過觸發Plexins相關的受體型和非受體型發揮生物功能，譬如調節細胞粘附和遷移等[13]，有文獻報道稱PlexinA4在膠質瘤細胞中異常高表達，通過RNA干擾技術下調PlexinA4表達后，神經膠質瘤細胞的增殖能力明顯受到抑制，S期細胞數量明顯減少[14]。本研究通過免疫組化檢測鼻咽鱗狀癌和癌旁組織中PlexinA4的表達，結果顯示PlexinA4在鼻咽鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率為86.67%(52/60)，明顯高于癌旁組織中的陽性表達率33.33%(20/60)，差異有統計學意義(χ2=35.556，P=0.000)。qRT-PCR結果也顯示鼻咽鱗狀細胞癌組織中的PlexinA4 mRNA的表達量顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.001)，提示PlexinA4能夠促進鼻咽癌的發生發展。

有學者研究發現miR-497和PlexinA4 mRNA在喉鱗癌中的表達呈明顯的負相關關系，且統計學結果顯示miR-497、PlexinA4 與喉鱗癌的分化程度密切相關[15]，為了進一步觀察miR-497和PlexinA4的關系，本研究采用生物信息學數據庫對miR-497的靶基因進行預測，并采用雙熒光素酶實驗檢測熒光素酶活性比值變化，結果顯示miR-497能夠明顯抑制靶基因PlexinA4在鼻咽癌細胞HEP-2中的翻譯水平。

綜上所述，miR-497在鼻咽鱗癌中高表達，高表達miR-497能夠抑制鼻咽鱗癌細胞系PlexinA4 基因減少及蛋白表達，并通過降低PlexinA4 的表達量來影響細胞轉移。可以將miR-497/PlexinA4作為研究的新方向，為新型的生物藥品提供理論基礎。