玻璃纖維固定化光合細菌連續產氫實驗研究

張桂芝，王星敏，彭榮，賀有周，張杰

(重慶工商大學 環境與資源學院，重慶 400067)

氫能是解決環境問題的最理想的能源[1]。生物制氫是發展新能源的一個重要研究方向[2]。具有其他制氫方法無法替代的優越性[3]。固定化光合細菌通常比懸浮態產氫能力要高[4]。但固定化載體如果不透光，將影響產氫效率[5]。而較小比表面積載體會使得固定化細菌生物量不夠，底物利用率低。且存在細胞與底物的接觸面積較小、傳質距離較遠、傳質阻力大等問題[6]。

本文制作了一種透光玻璃纖維固定化光合細菌連續產氫反應器，研究了光合細菌的固定化過程及其產氣特性，考察了底物中葡萄糖濃度，進料流速以及不同光源對產氫的影響，獲得了該反應器最佳產氣條件。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

玻璃纖維(φ9～20 μm)，產自中國醫藥集團上海化學試劑公司；葡萄糖、氯化銨、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、鹽酸、氯化鎂、氯化鈉、甲醛均為分析純；酵母膏為生化試劑；光合細菌菌種為產氫紅螺菌屬沼澤紅假單胞菌[7]。

TOC-VCPN總有機碳總氮分析儀；ZDS-10自動量程照度計；SY-9303B質量流量計；Spx-250-GB光照培養箱；SP6890氣相色譜儀：UV-3100PC紫外可見分光光度計；H20502-1高速冷凍離心機；FE20型酸度計。

1.2 實驗裝置

制氫反應器(圖1)采用透光性能良好的PMMA有機玻璃制成。反應室填充25 g玻璃纖維，作為光合細菌的固定化載體，周邊用緊固螺栓固定密封。光生化反應室容積為120 cm3，頂部氣室容積為12 cm3，床層采光面面積為200 cm2。反應器內介質流向設置為下進上出方式，反應產生的氣體由頂部設置排氣孔排出，進入排水集氣管。

圖1 反應器示意圖Fig.1 Reactor design

整個實驗裝置見圖2。用硅膠管連接各個部分，底物用恒流泵計量，氣體用帶刻度玻璃集氣管收集并計量。實驗所用玻璃設備均用高壓滅菌鍋滅菌，實驗開始前，整個管路先用36%甲醛溶液滅菌，再用滅菌的蒸餾水將整個流路徹底清洗。

圖2 實驗裝置示意圖Fig.2 The experiment system1.反應器；2.光源燈；3.恒溫箱；4.培養基儲瓶；5.蠕動泵；6.廢液瓶；7.集氣裝置

1.3 實驗方法

細菌固定化階段，使用生長培養基，接種光合細菌，采用循環掛膜法[8]，使光合細菌在反應器中的玻璃纖維上吸附生長。生長培養基[9]：NH4Cl 1.0 g/L，CH3COONa 2.0 g/L，NaHCO30.5 g/L，NaCl 1.0 g/L，KH2PO40.2 g/L，MgCl20.2 g/L，T.M液1 mL/L，酵母膏0.8 g/L。當玻璃纖維變成鮮紅色，培養液OD值>0.8時，即可認為固定化成功。

細菌固定化成功后，排出培養液，輸入產氫培養基，進行連續產氣實驗。產氫培養基配方：葡萄糖2～10 g/L，蛋白胨2.0 g/L，NaHCO30.4 g/L，KH2PO40.2 g/L，MgCl20.2 g/L，NaCl 1.0 g/L，T.M儲液1 mL/L，pH調節為7。采用總有機碳及總氮分析儀分析底物濃度變化，采用氣相色譜儀分析計算產氫速率[10]，分別考察不同光源、不同進料流速、不同底物濃度對產氫過程的影響。

2 結果與討論

2.1 固定化階段光合細菌的生長

將液體生長培養基接種后通過恒流泵注入到反應器中，循環流動培養，流速控制在1 mL/min，培養基總量為300 mL，接種6%左右對數生長期菌懸液。接種后發現，經過短暫的適應期，部分細菌就開始吸附生長在玻璃纖維上，使纖維呈現微紅色。

圖3 固定化階段培養基OD值變化曲線圖Fig.3 Change of OD600，TOC，TN versustime during immobilization stage

由圖3可知，接種24 h后，TOC開始急劇下降，液體培養基OD值快速升高。此階段細菌快速增值，處于對數生長期。細菌在纖維載體上大量生長，纖維的顏色變化明顯，紅色逐漸加深，培養液中游離的光合細菌也增多，因此OD值快速升高。整個固定化過程中，反應器出口端的氮源濃度變化不是很大，與碳源的消耗量及消耗速率相比，細菌對氮源的需求量及消耗速率并不大。

A.固定化光合細菌前 B.固定化光合細菌后圖4 玻璃纖維固定化光合細菌照片Fig.4 The photographs of photosyntheticbacteria immobilized on glass fiber

由圖4可知，固定化光合細菌前，反應器中的玻璃纖維為白色，接種120 h后，由于細菌在纖維上吸附生長，玻璃纖維顏色變為鮮紅色，證明光合細菌固定成功。根據圖3可知，接種120 h后，循環液OD值>0.8，且變化趨緩，氮源和碳源的濃度變得較低。當總有機碳<65 mg/L時，即可終止固定化過程。光合細菌固定化成功的反應器將用于連續產氣實驗。

2.2 光源對代謝產氫過程的影響

通過調節不同的光源與反應器之間的距離，保持同等光照強度2 000 lux，進行連續產氣實驗。

圖5 不同光源下TOC、TN消耗量與產氣速率Fig.5 TOC，TN consumption and hydrogen productionrate under different light sources

由圖5可知，對于白熾燈和日光燈，細菌產氣速率相當。由于吸收波長的原因，在鈉光燈作用下產氣速率較低，LED燈作用下產氣速率最大[11]。由于白熾燈光照過程中發熱量較大，使得光反應器局部溫度升高，而不利于光合細菌的代謝活動，因而產氣量較低。日光燈管由于呈柱狀，致使平面式采光面各處光照度不太一致，中間部分光照度較大，離燈管較遠的邊緣處則光照度較低，也導致產氣速率偏低。而LED光源呈平板式，各處光強相同，且能與采光面平行放置，使得反應器受光面各處光照度相當；同時，由于LED為冷光源，發熱量低，不會導致反應器溫度升高，從而有利于反應器溫度維持細菌生長的恒定溫度，保證其處于最佳代謝溫度，因而產氣率較其他光源高。不同光照情況下的TOC、TN含量則變化不太大，其中白熾燈、鈉光燈、日光燈作用下細菌對氮源和碳源的消耗量均偏低，LED燈照射下消耗的底物最多。這也與其產氣量最大相符。表明在這種光照條件下，有利于光合細菌的代謝和光照產氫，后續實驗均以LED燈作為光源。

2.3 進料流速對代謝產氫過程的影響

在相同的底物濃度及光照度情況下，底物進料速度對產氣速率會有顯著影響[12]。

圖6 流速對TOC、TN消耗量以及產氫速率影響Fig.6 Effect of flow rate on TOC，TN consumptionand hydrogen production rate

由圖6可知，在不同流速下，光合細菌對碳源和氮源的消耗量不同。當進料流速<4 mL/min時，隨著流速的增大，底物消耗量有小幅上升，在4 mL/min時達到最大值。提高反應器流速可以增加反應器中主流區與生物膜之間的對流傳質系數，起到強化底物從主流向生物膜傳質過程的作用[12]。但當流速>4 mL/min后，由于流速過快，擾動加劇，并可能將部分光合細菌生物膜沖刷掉，降低了生物膜對培養液中的營養物質的利用率，且由于底物在反應器內的停留時間過短，不利于TOC、TN在反應器內的傳遞和反應。因此，雖然過低的流速可能會增大傳質阻力，使得營養物質不能快速擴散至固定化細菌的細胞膜表面，但是增大了底物在反應器內的停留時間，因而底物消耗量比在高流速下的要高。對本反應器而言，對流傳遞不起控制作用，底物在生物膜內的擴散速率和菌體對底物的消耗速率決定了底物的利用效率[13]。產氣速率與底物消耗速率隨流速的變化呈現相同的趨勢。低流速更有利于固定化具體的產氣。因此，進料流速控制在4 mL/min為宜。

2.4 底物濃度對代謝產氫過程的影響

由圖7可知，細菌在葡萄糖濃度為6 g/L的情況下，產生氣體體積最大，此時，細菌底物中消耗的碳源、氮源均為最多。表明該細菌在葡萄糖濃度為6 g/L的情況下生長繁殖最活躍。隨著底物濃度的增加，反應器內主流區與生物膜區之間的傳質驅動勢也是逐漸增加，使得更多的底物被傳遞到生物膜區域用于產氫代謝[14]。因此，在低底物濃度情況下，反應器的產氫速率隨著底物濃度增大會逐漸增加。當反應器進口底物濃度繼續增加至6 g/L以上時，雖然傳遞到生物膜的葡萄糖量增大。但是超過了光合細菌生物膜的代謝能力，所以，產氫活性呈逐漸下降趨勢。結果表明，當傳質速率大于生化反應速率時，就會對生物膜代謝產生抑制作用，降低光合細菌生物活性，導致反應器的產氫速率降低。因而底物濃度必須維持在一個最佳的濃度范圍。

圖7 葡萄糖濃度下底物的消耗速率與產氫速率Fig.7 The rate of substrate consumption and hydrogenproduction of glucose concentrations

3 結論

(1)光合細菌能成功在玻璃纖維上固定化生長。通過不同光源下的對比產氣實驗，發現光照強度為2 000 lux下LED光源效果最佳。不同的進料流速下固定化光合細菌產氣量不同，高流速不利于產氣，最佳進料流速為4 mL/min。

(2)光合細菌在葡萄糖濃度為6 g/L時，細菌消耗的碳源、氮源均為最大，光合細菌生長繁殖最為活躍，固定化產生氣體量最大為61 mL/(h·m2)。

(3)采用透光玻璃纖維作為光合細菌固定化載體，既能增大光能的吸收量，又提高了生化反應床層的比表面積，增加了光合細菌的生物量，同時可以擴大菌落與底物的接觸面積，縮短傳質距離，從而能增大底物和光能利用率，提高產氫效率。