黑曲霉的產酸優化和對雞糞的間接生物浸出效果

鐘裕健，鄭莉，孫水裕，許燕濱，杜青平，謝光炎，劉艷婷，蔡秋杰，謝志帆

(廣東工業大學 環境科學與工程學院，廣東 廣州 510006)

近30年來，我國畜禽養殖業迅速發展。為了加快畜禽的生長、增強畜禽的抗病能力，追求經濟利益最大化，飼料中通常添加過量的銅、鋅、砷等微量元素，遠遠超過畜禽的吸收率[1]，并通過糞便和尿液的形式排出體外，導致糞便中重金屬含量過高[2]。畜禽糞便富含有機質和養分，是傳統的有機肥料[3]，但這些畜禽糞便作為肥料用于農田后會造成重金屬的積累，并可能對人體健康造成危害[4]。目前常規有效的解決方式有物理和化學方法兩種[5]，成本高且容易造成其他環境污染。隨著生物浸出方法的研究，由于其克服上述缺陷，運行成本低、應用范圍廣、操作簡單和污染小的優點引起了業內外的廣泛研究和關注[6]。

生物浸出技術最早應用于礦石中提取有用金屬[7-8]，根據這一原理應用于污染物的重金屬去除，發展為生物浸出技術[9]。現有的相關生物浸出方法多采用化能自養型細菌，或者是將自養和異養細菌混合培養投入使用。研究發現，部分異養菌在生物浸出時表現也較為優異。黑曲霉(Aspergillusniger)是目前在生物浸出中常用的真菌。其在生長代謝過程中產草酸、葡萄糖酸和檸檬酸等有機酸[10-12]，通常應用于污染土壤中浸出重金屬，并取得較好的效果。目前黑曲霉生物浸出主要應用于低品位礦石或尾礦[13-15]、城市燃燒垃圾飛灰[11，16-17]、赤泥[18-19]、廢棄電路板[20-22]，但對畜禽糞便的生物浸出報道比較少，尤其是黑曲霉間接生物浸出的研究。

本文選用黑曲霉作為畜禽糞便進行間接生物浸出，重點研究黑曲霉產有機酸的優化，生物浸出去除畜禽糞便重金屬的效果以及浸出過程中重金屬形態的變化。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

蔗糖、酵母浸膏、瓊脂、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸鐵、磷酸、過氧化氫、鹽酸、硝酸、氯化鎂、醋酸、醋酸鈉、醋酸銨、鹽酸羥胺均為化學純；雞糞，取自廣州市番禺某養雞場(烘干，研磨過60目篩網)，基本性質分析見表1。

表1 雞糞的基本理化性質

AUY220型電子分析天平；SHA-B型恒溫振蕩器；Sorvall Legend T型高速離心機；ZSD-A1090A型生化培養箱；OPTEC型光學顯微鏡；無菌操作臺；LDZM-40KCS型高壓蒸汽滅菌鍋；PHS-25型pH計；Bio-rad S1000TM Thermal Cycler PCR儀；TSQ Endura三重四極桿液質聯用儀；Z-2000型原子吸收光譜；AF-640A型原子熒光光譜。

1.2 菌種培養[23]

雞糞在錐形瓶富集培養后，再涂布查氏固體培養基。利用溴甲酚綠的查氏篩選平板連續劃線純化得到數株菌。將相同濃度的不同菌種的孢子，分別接種在滅菌的蔗糖培養基(100 g蔗糖，1.6 g酵母浸膏，1.5 g NaNO3，0.5 g K2HPO4，0.025 g MgSO4·7H2O，0.025 g KCl，1 L去離子水)[24]，于30 ℃、120 r/min條件下振蕩培養6 d，選取培養基pH最低的菌種樣本進行鑒定。

1.3 實驗方法

1.3.1 產酸實驗 將黑曲霉在蔗糖平板上培養7 d，用無菌棉簽刮下孢子，在裝有無菌水的錐形瓶中洗下孢子，振蕩搖勻，配制成黑曲霉孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計數板計算濃度，經過進一步的稀釋后，孢子濃度約為1.0×107個/mL。在無菌蔗糖培養基中接入20 mL/L的孢子懸浮液，于30 ℃、120 r/min條件下進行純培養，每2 d取培養液進行有機酸的測定。

1.3.2 間接生物浸出實驗 在黑曲霉產酸優化的實驗中，選擇產酸量最大的一組進行生物浸出實驗。培養液經過濾紙過濾得到無細胞培養濾液，用于雞糞的浸出[25]。在錐形瓶中裝入100 mL的培養濾液，加入40 g/L的雞糞樣品，瓶口蓋上棉紗。置于30 ℃，180 r/min的恒溫振蕩器內進行浸出實驗。實驗器皿都經過滅菌處理。每組實驗設置3個平行樣。浸出過程中，每4 h取上清液，測定其中的重金屬濃度(Cu、Zn和As)。

通過Tessier五步法[25]測定浸出過程中雞糞重金屬的形態變化。提取步驟見表2。準確稱取1 g(精確到0.000 1 g)雞糞樣品，每個形態提取完后，進行15 000 r/min離心15 min，保留沉淀的樣品，上層清液用于測定重金屬含量。沉淀樣品用去離子水洗滌2次后，離心，棄去上層清液，然后進行下一個形態的提取。

表2 Tessier五步提取法Table 2 Tessier’s five step of extraction procedure

1.4 分析方法

雞糞用微波消解儀消解，重金屬含量用火焰原子吸收光譜儀和原子熒光光譜進行測定[26]，有機質含量用燃燒法進行測定，有機酸含量用三重四極桿液質聯用儀測定。

2 結果與討論

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態學鑒定 觀察菌種樣本培養在蔗糖平板中的菌落狀態，用顯微鏡觀察孢子的形態結構等。結果見圖1。

圖1 黑曲霉在平板(a)和顯微鏡下(b)的形態特征Fig.1 Morphological photographs of Aspergillus niger on PDA medium (a) and microscope (b)

由圖1可知，菌株在蔗糖培養基上培養3 d，出現圓形的菌落，表面為毛絨狀的突起；培養初期為黃白色的菌絲，后生長成黑褐色的孢子。根據《真菌鑒定手冊》，初步判斷篩選所得菌株為黑曲霉(Aspergillusniger)[23]。

2.1.2 分子生物學鑒定 采用真菌DNA試劑盒提取菌種樣本的DNA，并進行PCR擴增18S rDNA-ITS序列，對序列雙向測序與NCBI數據庫內庫序列比較，發現18S rDNA-ITS序列和Aspergillusniger相近，同源度僅存在1%的差異性。將序列提交到NCBI后，該黑曲霉菌株的登錄序列號為MH978907。采用MEGA 5.0軟件構建該菌的系統發育樹(圖2)。結合形態觀察和培養特性的初步鑒定，確認篩選所得菌株為黑曲霉(Aspergillusniger)[27]。

圖2 黑曲霉菌株的系統發育樹

2.2 產酸條件優化

2.2.1 產酸特性 黑曲霉在生長代謝過程中，將簡單高分子碳水化合物如蔗糖轉化為檸檬酸、葡萄糖酸、草酸等低分子有機酸，導致體系的pH逐漸下降，從初始的5.7下降到1.5。

由圖3可知，培養6 d，葡萄糖酸產量達到最高(17.50 mmol/L)，后期基本趨穩，略有下降，維持在10 mmol/L左右；草酸的產量迅速增加，第4 d達到14.28 mmol/L，隨后逐漸降低，在15 d降低至2.60 mmol/L。檸檬酸的濃度則隨著培養時間上升。有研究指出，體系中的pH對黑曲霉分泌葡萄糖酸有很大影響，在pH 4.5～6.5時葡萄糖氧化酶的活性最大，葡萄糖酸的產量也最多，在pH<3.0時氧化酶的活性受到抑制，從而導致葡萄糖酸的產量速率下降[28]；而培養4 d后，草酸可能參與檸檬酸的代謝循環被分解，導致草酸的濃度下降，檸檬酸的濃度持續上升[23]。總體上看，培養15 d時檸檬酸的產量最高(71.34 mmol/L)，而葡萄糖酸(10.47 mmol/L)處在較穩定水平，草酸(2.60 mmol/L)有所下降，培養液的pH接近 1.5，這一酸性環境有利于將畜禽糞便的重金屬浸出。崔雨琪[23]曾報道黑曲霉純培養20 d產酸分別為：檸檬酸約55 mmol/L，葡萄糖酸約20 mmol/L，草酸約16 mmol/L。由于檸檬酸的產量遠大于其他兩種有機酸，且檸檬酸對重金屬浸出起主要作用，因此，設計正交實驗優化檸檬酸的產量。

圖3 黑曲霉產酸趨勢圖

2.2.2 正交實驗 以蔗糖濃度、接種量和培養溫度3個因素設計L9(34)正交實驗，確定產酸的最優條件，因素與水平見表3。每種實驗重復3次，結果見表4。

表3 正交實驗因素水平

表4 正交實驗結果Table 4 Result of orthogonal experiment

由表4可知，3種因素對檸檬酸的產量的影響由大到小依次為培養溫度(C)、接種量(B)、蔗糖濃度(A)。其最優方案是A2B2C2，即培養基的蔗糖濃度為100 g/L、接種量為40 ml/L、培養溫度為30 ℃。

對最優方案進行驗評實驗，平行3次，結果檸檬酸產量為71.23 mmol/L，因此，上述條件最適合黑曲霉產檸檬酸。

2.3 重金屬浸出率

圖4為雞糞中各重金屬去除過程的動態變化情況。

圖4 間接生物浸出雞糞的重金屬浸出動態Fig.4 Trends in metal removal of chicken manure by indirect bioleaching

由圖4可知，含有大量有機酸的培養濾液對雞糞重金屬浸出有不錯的效果。間接浸出主要的作用機理是酸解。酸化(質子流出)有利于金屬遷移，而且是真菌浸出過程中最重要的機制，因為質子與金屬陰離子中的金屬之間的競爭或被吸收的形式，游離的金屬陽離子釋放到浸出液中，可導致固廢中金屬的遷移。酸解在浸出過程中的作用取決于培養濾液的pH。酸解和絡合分解分別在強酸性和弱酸性條件下起作用。在酸解過程中，氫離子的濃度在堿性階段下降，在堿性階段，絡合分解占據并控制了大部分金屬的溶解[29]。浸出過程中，pH變化不大，從3.6升高到4.1。浸出4 h，Cu、Zn、As浸出率分別為55.35%，69.06%，34.53%。隨著浸出時間加長，最終20 h的Cu、Zn、As浸出率分別為63.93%，79.22%，42.55%。Zn的浸出效果最佳，Cu次之。檸檬酸和葡萄糖酸是生物浸出中Cu和Zn的主要和有效的浸出劑[30]。Qu[18]曾報道間接浸出2%濃度的紅泥，20 d后浸出率分別為Cu約50%，Zn約80%，As約40%。雖然本實驗的浸出率比報道略有偏低，但是浸出時間縮短10 d。

根據《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準(試行)(GB 15618—2018)》[31]的農用地土壤污染風險篩選值規定，Cu、Zn、As的最低含量在50，200，20 mg/kg以下。由表5可知，經過生物浸出后，Cu、Zn和 As達到土壤環境標準，這說明生物浸出可以實現雞糞重金屬的減量化，雞糞作為有機肥料用于農業施肥。

表5 農用地土壤污染風險篩選值和雞糞重金屬含量Table 5 Farmland soil pollution risk control standard and heavy metal content of chicken manure (mg/kg)

2.4 浸出過程中重金屬形態變化

金屬形態的分布代表雞糞中重金屬的穩定性和生物有效性，也代表生物浸出的效率。根據Tessier[26]分類重金屬形態有5種，而且具有不同的能量狀態。可交換態、碳酸鹽結合態、鐵錳氧化物結合態，這3種的穩定性更差，有較高的風險性和生物可利用性。有機物結合態和硫化物結合態、殘留態相對比較穩定，更難被生物利用[25]。

對生物浸出不同階段的雞糞樣品進行重金屬提取的結果見圖5。

圖5 生物浸出過程中Cu、Zn、As的重金屬形態變化Fig.5 The variation of Cu，Zn and Asspeciation during the bioleaching

由圖5可知，生物浸出對殘留物中金屬的形態有明顯的變化。對于原始樣品而言，Cu的重金屬形態主要集中在有機物結合態和硫化物結合態(84.83%)。浸出20 h后，占比從84.83%減少至33.77%，其他重金屬形態的比例僅有微量的減少。對于Zn，重金屬形態大部分為鐵錳氧化物結合態(56.91%)、有機物結合態和硫化物結合態(27.56%)。浸出20 h后，鐵錳氧化物結合態下降到13.64%，而有機結合態和硫化物結合態則是下降到5.11%。前12 h，殘留態的比例隨時間下降，后8 h卻略微上升，推測是鐵錳氧化物結合態的溶解導致殘留態的增加。生物浸出對各形態的As均有減少，鐵錳氧化物結合態減少19.34%，殘留態減少9.12%，其他3種形態平均減少6%。考慮到原雞糞中5種形態的占比，4種形態的As降低幅度接近(5%～8%)，而殘留形態的降低幅度最少(2%)。表明殘留態的As比較穩定，不易被浸出。

經過黑曲霉培養濾液的浸出后，雞糞的生物有效性大大降低(表6)。根據風險評價準則 (RAC)[32]，以生物有效性較高的重金屬形態所占的比例W將風險程度分為以下5種：無(W<1%)、低(1% ≤W≤10%)、中等(11% ≤W≤30%)、高(31% ≤W≤50%)、非常高(W>50%)。經過20 h的浸出之后，Cu和As的生物有效性很低(約為2%和9.71%)，RAC等級劃分為低，這說明浸出后Cu和As的可生物利用性低，對環境構成的風險較低；而Zn對環境構成的風險從非常高(64.05%)，降低到中等(14.72%)，這說明生物浸出大大降低了Zn的生物利用性。只需經過再一步的無害化處理，雞糞對環境構成的風險更低。

表6 雞糞經生物浸出后的生物有效性Table 6 Bioavailability of chicken manure after bioleaching

3 結論

(1)從雞糞中分離得到產酸黑曲霉，黑曲霉生長代謝過程中分泌葡萄糖酸、檸檬酸和草酸，檸檬酸的產量遠超過其他有機酸。在優化條件蔗糖濃度100 g/L、接種量40 mL/L、溫度30 ℃下檸檬酸最大產量約為71.23 mmol/L。

(2)經過20 h的間接生物浸出后，重金屬Zn浸出率最高，為79.22%，Cu和As浸出率分別為63.93%，42.55%，達到新實施的土壤環境質量標準。

(3)生物浸出對雞糞中3種重金屬的形態有明顯的影響。生物浸出后，雞糞的生物可利用性有不同程度的降低，對環境構成的風險大大降低。