木聚糖酶原位協同水解預處理大米草的研究

楊旸，劉健，甘禮惠，龍敏南

(廈門大學 能源學院，福建 廈門 361102)

目前，利用半纖維素獲取木寡糖的常用方法為酶水解。相較于其他方式[1-2]，酶水解污染小且產生的副產物少[3-4]。然而由于生物質結構復雜，直接酶解的效率低[5]，故實驗使用了氨水/雙氧水與球磨相結合的方式預處理大米草，在脫除木質素的同時保留了相當量的半纖維素，并破壞其結晶結構。

大米草中除木聚糖外還含有2.13%的側鏈阿拉伯糖[6]。因此，實驗選擇了源于黑曲霉，在畢赤酵母中高效表達的重組內切-β-1，4-木聚糖降解酶和重組α-L-阿拉伯糖苷酶水解經預處理后的大米草。探究了氨水/雙氧水與球磨預處理方式相結合及協同酶解對大米草木聚糖水解效率及協同降解機制的影響。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大米草，收割于福建省廈門市翔安區沿海灘涂，粉碎至40～60目；氨水(25%～28%)、雙氧水(30%)、硫酸(98%)均為分析純；檸檬酸緩沖液(50 mmol/L，pH 5)；實驗所用酶為實驗室保存重組內切-β-1，4-木聚糖降解酶(AnXyn10C，XC，306 IU/mL，GenBank accession No.KJ601783)，α-L-阿拉伯糖苷酶(AnAxh62A，AX，38.9 IU/mL，GenBank accession No.KJ601782)來源于黑曲霉，在畢赤酵母中高效表達。

FIWE 纖維素測定儀；QM-3Spartina04 行星式球磨機；Rigaku ULTIMA IV X射線衍射儀；Nicolet iS5 傅里葉變換紅外光譜儀；SUPRA 55 場發射掃描電鏡；Molecular Devices美國M2多功能酶標儀；Waters2695 高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨水/雙氧水預處理 稱取2 g大米草，32 g去離子水，2 g雙氧水及6 g氨水，加入120 mL(46 mm×130 mm)耐壓瓶中。充分浸泡后的混合物分別在110，120，130 ℃的恒溫油浴鍋中反應1，3，4，5，6 h。反應結束后過濾分離固體，并用去離子水多次沖洗固體至中性，在75 ℃下烘至絕干，稱重后置于干燥皿室溫保存待用。

1.2.2 球磨預處理 稱取200 mg氨水/雙氧水預處理大米草及原料大米草于瑪瑙球磨罐，400 r/min下球磨2 h。球磨后的固體置于干燥皿室溫保存待用。

1.2.3 酶水解 準確稱取200 mg底物于離心管，分別或同時加入135 μL的AnXyn10C與46 μL的AnAxh62A，再添加檸檬酸緩沖液至固∶液=1∶100(g/mL)，在50 ℃恒溫混勻儀中300 r/min反應24 h。反應結束后將離心管置于沸水中煮10 min滅活，再置于離心機，12 000 r/min離心5 min，收集上層清液，-20 ℃ 冷凍保存待用。計算木聚糖水解率。

木聚糖水解率=10C/S

式中C——酶水解產物中還原糖濃度，mg/mL；

S——預處理后固體中剩余的半纖維素含量，%。

1.3 結構與表征

1.3.1 化學組成分析 原料大米草及預處理大米草的成分確定方法參考NREL方案[7]。酶水解液中的成分由帶有紫外檢測器及C18柱(CAPCELL PAK C18MGⅡ)的高效液相(HPLC)分析確定，方法參考文獻[8]。

1.3.2 SEM分析 原料大米草及預處理大米草的表面形態由場發射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。所有樣品粉末經過噴金處理，在20 kV下操作。

1.3.3 XRD分析 將原料大米草及預處理大米草于紅外干燥箱下干燥2 h，用瑪瑙研磨皿充分研磨至粉狀待測。測試條件：Cu靶(Kα=0.154 nm)，管電流40 mA，管電壓40 kV，掃描率為3(°)/min，從10～60°。

1.3.4 FTIR分析 將原料大米草及預處理大米草與KBr按1∶100(w/w)混合，在紅外烘干箱中研磨至粉末狀。用傅里葉變換紅外光譜儀進行分析，測試條件：4 000～500 cm-1波數范圍，32次掃描，所有情況下光譜分辨率保持在4 cm-1。

2 結果與討論

2.1 氨水/雙氧水預處理大米草的化學組成

原料大米草的組成為纖維素34.04%，半纖維素26.45%，木質素25.73%，水分含量約9.80%。由表1可知，經過不同堿預處理后，大米草的固體回收率為49.00%～57.01%。其中固體的損失主要是由于生物質在堿預處理中有部分成分溶解，如木質素及半纖維素等。大部分的纖維素及相當量的半纖維素被保留在了固體中，尤其是纖維素，大米草中超過95.00%的纖維素被保留了下來，沒有受到堿預處理的影響。這是由于氨水對纖維素/半纖維素低反應性[9]的結果。由表1可以看出，最高和最低的木質素脫除率分別為73.39% 及 61.75%，分別在堿處理條件為120 ℃，6 h 和 120 ℃，1 h 時發生。木質素的脫除主要是由于氨破壞了木質素分子間的酯鍵，而雙氧水通過其氧化作用加速了這一過程[9-10]。這些結果說明，氨水/雙氧水的預處理可以在保留相當量的纖維素/半纖維素的情況下，脫除大部分的木質素，而木質素的脫除程度則隨著預處理條件的加劇而增大。由表1中還可以看出，堿預處理溫度從110 ℃ 升至130 ℃，木質素脫除率從65.36% 升到 68.87%，盡管木質素脫除量增加，但纖維素/半纖維素損失也隨之增大。這說明嚴苛的氨水/雙氧水預處理條件盡管有利于木質素的脫除，但同時也會導致纖維素/半纖維素的損失增大，從而使后續酶水解的糖得率降低。

表1 經不同堿預處理條件處理的底物的化學成分

2.2 預處理大米草結構的表征

2.2.1 SEM 由圖1a可知，大米草原料微觀呈桿狀，相較其他兩組表面更光滑，原料經球磨后破碎成硬質細小顆粒狀分散，見圖1b。由圖1c可知，經過堿預處理的大米草，結構被一定程度的破壞，其微觀形態雖然不如球磨處理物細小，但呈更為松散的絮狀物狀態。從酶解效率來說，底物結構破壞程度越大，酶對底物的可及性越高，酶解效率也就越高。因此，無論經過堿處理還是球磨處理，都有利于后續的酶解效率的提高。

圖1 原料(a)、經球磨處理的原料(b)、120 ℃，4 h 堿預處理的大米草(c)的掃描電子顯微鏡圖片Fig.1 SEM micrographs of raw material(a)，raw material through ball-milling(b)，120 ℃，4 h alkaline-treated condition Spartina (c)

2.2.2 XRD 經過球磨處理的大米草及其原料的結晶情況，XRD分析見圖2。

圖2 原料(a)、120 ℃，4 h 堿預處理的大米草(b)、經球磨處理的原料(c)的X射線衍射圖

由圖2可知，最大的峰 2θ=22°代表了天然纖維素(002)衍射面[9]，小峰 2θ=34° 代表了(004)衍射面，這個峰在球磨預處理的底物圖2b中不再明顯，說明結晶區有所破壞。而在經過球磨預處理的底物圖2c中則已經被完全消失。可知，球磨對生物質底物結晶度的破壞明顯，這是因為球磨對纖維素的結晶區域具有破壞作用[11]。

2.2.3 FTIR 圖3是不同處理條件下底物的紅外分析譜圖。

由圖3可知，3 400 cm-1代表生物質中吸附的水分子的O—H伸縮振動峰；2 910，1 420 cm-1主要對應的是對稱和不對稱的C—H伸縮振動；1 060 cm-1附近的兩個峰與碳水化合物的C—O和C—H伸縮振動有關[12]；895 cm-1與纖維素中的C—H 振動有關，是纖維素的吸收特征峰；1 260 cm-1是木質素酯鍵的C—O—C振動造成的?？芍獰o論是球磨，還是氨水/雙氧水的預處理，基本都不改變底物的成分，只改變組分含量。

圖3 原料(a)、經球磨處理的原料(b)、120 ℃，4 h堿預處理的原料(c)的傅里葉紅外光譜圖

2.3 預處理對木聚糖降解酶協同作用的影響

大米草經過氨水/雙氧水120 ℃預處理4 h時，酶解還原糖得率見表2和圖4，堿預處理結合球磨處理的大米草酶解還原糖得率見表3和圖5。

表2 堿預處理底物的還原糖得率

圖4 經不同溫度(4 h)、不同時間(120 ℃)堿預處理的底物及原料的酶解所得還原糖濃度Fig.4 The reducing sugar concentration of substrate just pretreated by alkali at different temperatures(4 h)， at different time (120 ℃) and raw material

由表2及表3可知，經過球磨預處理的底物，協同酶解所得的還原糖濃度是沒有經過球磨的近7倍，未經過球磨的底物即使在木質素脫除率很高的情況下，半纖維素仍然沒有很高的協同酶解率(表2)，由圖4可知，兩種木聚糖降解酶間的協同作用并不明顯。這主要是由于堿預處理無法破壞纖維素的結晶結構，而這些結晶結構阻礙了木聚糖降解酶對半纖維素的可及性。

表3 堿預處理結合球磨處理底物的還原糖得率Table 3 The reducing sugar yield of alkali pretreatment conditions that combined with ball-milling

注：只經球磨處理的大米草。

由圖5可知，兩種酶協同的效果優于單獨使用其中一種酶。這主要是因為AnXyn10C能夠切斷木糖單元間的β-1，4糖苷鍵，從木聚糖主鏈上釋放木單糖[13]，Axh62A則能通過水解木聚糖側鏈上阻礙AnXyn10C作用于主鏈的阿拉伯糖基來改善水解效果[14]。在110 ℃、堿預處理4 h結合球磨，木聚糖降解酶的協同酶解可以得到最高的還原糖得率。故選擇110 ℃、4 h作為酶解底物的預處理條件，通過液相分析可知，水解物成分木糖占12.54%，木二糖占40.38%，阿拉伯糖占4.65%。說明經過預處理的底物由木聚糖降解酶協同酶解，除了產生木糖外，更多產生具有高附加價值的木寡糖。

圖5 經不同溫度(4 h)、不同時間(120 ℃)堿預處理結合球磨(BM)預處理的底物及原料(R)酶解所得還原糖濃度

3 結論

(1)氨水/雙氧水預處理能夠有效脫除大米草中所含的木質素，有利于后續木聚糖降解酶的水解，但對纖維素的結晶結構無影響。

(2)球磨預處理可以破壞生物質所含纖維素的結晶區域，從而降低底物的結晶度，使得木聚糖降解酶對底物的可及性增大。故球磨與氨水/雙氧水預處理相結合可促進木聚糖降解酶的酶解。

(3)實驗室的重組木聚糖主鏈酶及側鏈酶可以結合氨水/雙氧水及球磨預處理更大程度的發揮對大米草的協同酶解效果。生產具有高附加價值的木寡糖和阿拉伯糖。