基于生物信息學miR-221調控前列腺癌分子機制的研究

張世昌 鄭 江

長江大學附屬第一醫院，湖北省荊州市 434000

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)具有高度激素敏感性, 是男性泌尿系統常見的惡性腫瘤，發生骨轉移和復發的概率較高, 患者預后不良，前列腺癌的發病率和死亡率正逐年升高[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約為22個核苷酸(nt)的非編碼RNA,miRNA可通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(3’-UTR)互補配對,在轉錄后水平調控基因的表達, 導致mRNA的降解或翻譯抑制[2], 通過參與細胞增殖、凋亡等多種生理過程，對疾病發揮重要的調節作用，與多種腫瘤的發生關系密切[3]。有研究表明[4],miR-221可以調控前列腺癌細胞的凋亡、生長、侵襲等多種生物過程，可能與其激活JAK/STAT信號通路有關，說明miR-221與前列腺癌的發生關系密切。

GEO數據庫[5]是物種基因表達的在線數據庫。本研究在GEO數據庫獲得了數據集GSE45627[4]，該數據集包括兩種樣本，一是過表達的miR-221前列腺癌細胞樣本，二是正常表達miR-221的前列腺癌細胞樣本。通過對這兩個樣本數據的分析和比較，得到miR-221調控前列腺癌的重要靶點。對基因進行功能富集分析、蛋白—蛋白質互作(PPI)網絡和模塊分析。本研究結果可以為以后的基礎實驗提供可靠的作用靶點基因。

1 材料和方法

1.1 基因芯片數據 GSE45627基因表達數據來源于GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，研究類型為expression profiling by array，在GPL570平臺上表達(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)。GSE45627數據集為前列腺癌細胞，物種是人，其中過表達miR-221前列腺癌細胞2例(n=2)，正常表達miR-221的前列腺癌細胞2例(n=2)。

1.2 識別DEG 利用Morpheus軟件(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)制作熱圖對基因芯片數據進行分析，觀察基因表達的情況。利用在線分析工具GEO2R[6]對表達的差異基因進行分析和篩選，篩選的條件為P<0.01和|log2FC|≥1。利用Graphpad Prism軟件制作火山圖，觀察篩選的差異基因。

1.3 差異基因功能和通路富集分析 用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行差異基因的注釋。基因功能富集包括分子功能和生物過程以及細胞組分。信號通路的富集分析主要是用到KEGG數據庫，KEGG(http://www.genome.jp/)是一個包含KEGG信號通路的數據庫，用于檢查基因簇的路徑和相關功能。

1.4 PPI網絡的建立和模塊的分析 利用String[7]數據庫(http://www.string-db.org/)的檢索工具可以檢索已知和預測的蛋白質之間的關聯，并且通常用于預測分子生物學中的PPI信息。將差異基因導入String數據庫，得到差異基因相互作用的數據。Cytoscape3.5.0(http://www.cytoscape.org/)用于顯示差異基因互作關系的結果。對PPI網絡的結果進行了模塊分析，采用了與Cytoscape相關的Mcode聚類算法進行模塊分析，模塊分析可以用來識別更多的連接基因群。

2 結果

2.1 篩選基因結果 用Morpheus軟件制作的熱圖觀察所有基因的表達情況，如圖1所示。并且鑒定了過表達miR-221前列腺癌細胞與正常表達miR-221前列腺癌細胞基因表達的差異。利用在線分析工具GEO2R篩選出108個基因，其中18個基因上調，90個基因下調，如圖2所示。

圖1 所有樣品前50個基因的表達情況

注：根據旁邊色階柱，越往下的顏色代表基因表達量下降。

圖2 所有基因的火山圖

注：紅色：上調基因，綠色：下調基因，黑色：不受調控的基因。

2.2 基因功能富集分析 篩選出來的基因大多數位于細胞質、細胞核。這些基因通過雙鏈RNA結合、螺旋酶活性、雙鏈DNA結合、蛋白結合、單鏈RNA結合等發揮分子功能。此外，這些基因還通過參與調節Ⅰ型干擾素信號通路、對病毒的防御反應、病毒基因組復制的負調控、先天免疫反應等參與miR-221調控前列腺癌的發病過程。基因功能富集分析結果如圖3所示。

2.3 KEGG信號通路分析 篩選出來的基因通過單純皰疹感染信號通路、甲型H1N1流感信號通路、麻疹信號通路、RIG-I樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、乙型肝炎信號通路等途徑參與了miR-221調控前列腺癌細胞的過程。KEGG分析結果如圖4所示。

圖3 差異基因功能富集分析

圖4 差異基因KEGG信號通路分析

2.4 PPI網絡和模塊分析 基于PPI網絡的分析之后，在Cytoscape中識別出75個節點和2 236個相互作用關系，如圖5所示。其中相互作用關系較多的基因是中樞基因，因為相互作用關系多的基因與疾病的關系更加密切。其中信號轉導和轉錄激活因子1-α/β(STAT1)、干擾素調節因子7(IRF7)、干擾素誘導的螺旋酶c結構域蛋白1(IFIH1)、干擾素誘導的GTP結合蛋白(MX1)、干擾素誘導的四肽重復序列3蛋白(IFIT3)、寡腺苷酸合酶2(OAS2)、泛素樣蛋白15(ISG15)、依賴ATP的RNA解旋酶(DDX58)、鳥苷酸結合蛋白1(GBP1)、寡腺苷酸合酶1(OAS1)為前十位。 通過mcode分析，選擇了1個模塊，已經在圖中圈出，這些基因具有一些共同的表達特征，值得我們進一步去研究，如圖5所示。

圖5 差異基因蛋白相互作用網絡

3 討論

前列腺癌是一種臨床較為常見的疾病, 發病機制十分復雜, 當人體免疫力下降, 細胞內遺傳物質DNA發生異常變化后, 細胞就會不受正常調節機制控制而出現異常生長, 產生癌變[8-9]。有研究表明[9-10]，前列腺癌的發生與結核桿菌和HPV病毒關系密切。本研究對miR-221過表達調控前列腺癌細胞差異表達的基因進行了篩選，共篩選出差異基因108個，其中18個上調基因，90個下調基因，對這些基因進行了基因功能和信號通路的富集分析結果表明，這些基因主要的功能有與雙鏈RNA結合、雙鏈DNA結合、蛋白結合、單鏈RNA結合，這些基因還通過參與調節Ⅰ型干擾素信號通路、對病毒的防御反應、病毒基因組復制的負調控、先天免疫反應，說明miR-221主要通過調控基因的這些功能，來參與前列腺癌的形成過程。這些基因主要富集在單純皰疹感染信號通路、甲型H1N1流感信號通路、Toll樣受體信號通路、乙型肝炎信號通路上，說明這些基因參與了病毒感染的調節過程。

構建了差異之間相互關系的PPI網絡，其中STAT1、IRF7、IFIH1、MX1、IFIT3、OAS2、ISG15、DDX58、GBP1、OAS1為前10個樞紐基因。STAT1是信號轉導和轉錄激活劑，介導細胞對干擾素(IFN)及其他生長因子的反應。隨著Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)與細胞表面受體的結合，通過蛋白激酶的信號傳導導致JAK激酶的激活，磷酸化的細胞二聚體與ISGF3G/IRF-9結合形成一個復合物，稱為ISGF3轉錄因子，進入細胞核。ISGF3與IFN刺激反應元件結合，激活IFN刺激基因的轉錄，使細胞處于抗病毒狀態[11]。IRF7是Ⅰ型干擾素(IFN)依賴免疫應答的關鍵轉錄調控因子，在對DNA和RNA病毒的天然免疫應答中起著至關重要的作用。Ⅰ型干擾素基因(IFN-α和IFN-β)和IFN-刺激基因(ISG)的轉錄通過與其啟動子中的干擾素刺激反應元件(ISRE)結合來調控。可以有效地激活IFN-β和IFN-α基因，并通過病毒激活的myd 88非依賴性途徑和TLR激活的MYD88依賴途徑介導它們的誘導[12]。IFIH1作為病毒核酸的細胞質傳感器的天然免疫受體，在傳感病毒感染和包括誘導第Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子在內的一系列抗病毒反應的活化中起重要作用。MX1作為干擾素誘導的GTP酶結合蛋白，具有抗病毒活性，對RNA病毒和DNA病毒均有作用，它主要的作用目標病毒是負鏈RNA病毒和乙型肝炎病毒，作用方式通過核糖核衣殼結合和滅活[13-14]。IFIT3是干擾素誘導的抗病毒蛋白，可以抑制病毒復制。增強MAVS介導的宿主抗病毒反應，進入細胞核促進抗病毒基因轉錄[15]。OAS2和OASI是干擾素誘導的雙鏈RNA激活的抗病毒酶，在細胞固有抗病毒反應中起著關鍵作用，它還可能在細胞凋亡、細胞生長、分化和基因調控等其他細胞過程中發揮作用[16]。ISG15作為泛素樣蛋白，它在病毒感染的天然免疫反應中起著關鍵作用，DDX58作為天然免疫受體及病毒核酸的細胞質傳感器，在檢測病毒感染和激活一系列抗病毒反應中起著重要作用，包括誘導Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子[17]。GBP1在兩個連續的裂解反應中將GTP水解成GMP。具有抗流感病毒活性。促進氧化殺滅和提供抗菌肽自噬瘤小體，提供廣泛的宿主保護對不同的病原體類別[18]。

差異基因的深入分析有助于確定miR-221調控前列腺癌發病機制中有用的靶點和途徑。這些結果可為臨床治療靶點的研究提供理論依據。本研究篩選的中樞基因需要進一步驗證，這可能成為未來研究的重點。