胰腺癌組織LncRNA XIST及MiRNA-101表達差異與臨床病理特征相關性分析*

張 洲 陳 鵬 章 琴 奚士航 王 峻 王小明

1 皖南醫學院第一附屬醫院弋磯山醫院肝膽外科,安徽省蕪湖市 241001； 2 皖南醫學院研究生學院

目前胰腺癌在消化道惡性腫瘤疾病中并不少見，具有高度惡性，對放療和化療不敏感，使得臨床治療非常困難。患者的預后也很差，5年生存率低于5%，長期生存率低于15%，在歐洲和美國癌癥相關死亡人數中排名第四，俗稱“癌癥之王”[1]。由于胰腺癌患者早期癥狀不典型，早期診斷不易，大部分患者就診時已是晚期。目前，不到20%的患者在確診后進行手術治療，手術治療患者的中位生存期僅為12.6個月，未經外科治療的患者中位生存期僅3.5個月。即使患者得到手術根治，亦需要面對高復發率和轉移率的風險[2]。長鏈非編碼 RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度超過200核苷酸的 RNA分子，不編碼蛋白，位于細胞核或胞質內[3-4]。微小RNA(MiRNA)是長度為18～23bp的內源非編碼單鏈RNA分子。他們均與胰腺癌的生物學特性有密切聯系[3-5]。因此，本研究通過對LncRNA XIST及MiRNA-101在基因層面的表達分析來映射臨床病理特征，找出其中的相關性，為其在臨床上用作診斷標記物或是分子治療靶標提供相關依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2017年2月—2019年4月于我院行胰腺癌手術患者共50例，術后病理均為原發胰腺癌，其中胰腺導管腺癌46例，腺泡細胞癌1例，導管黏液癌3例，男29人，女21人，根據TNM標準Ⅰ期2例，Ⅱ期24例，Ⅲ期24例。所有患者在術前均未行任何化放療治療。

1.2 材料 TRIzol RNA分離試劑為賽默飛公司產品、RNA提取所需化學試劑均來自Biosharp公司，西格瑪低溫高速離心機。PCR引物合成由廣州銳博生物科技有限公司提供，所有實驗試劑盒(逆轉錄、基因擴增試劑盒)均購自寶生物(Takara)公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA：提取收集50例患者術中切除的腫瘤組織及癌旁組織塊(1.0cm×1.0cm×1.0cm)置于冷凍管中并儲存在液氮中(25例為手術切除的腫瘤組織，25例為手術切除的癌旁組織)。每例各取腫瘤組織標本200mg，癌旁組織200mg作為對照，均在液氮中勻漿器研磨后將組織樣品按200mg加入1ml Trizol，轉移入離心管。以12 000轉/min離心5min，棄去沉淀，每個試管中加入200μl氯仿，并蓋上管。用手搖動15s，在室溫下靜置10min，在4℃下以12 000轉/min離心14min，并吸出上層水相。移至另一個新的離心管中，每1ml Trizol加入0.6ml異戊醇，混合并靜置5～10min。然后，在4℃下以12 000轉/min離心4min，棄去上清液，每個試管再加入1ml 75%乙醇，輕輕搖動混合物以懸浮沉淀物，獲得總RNA。

1.3.2 LncRNA XIST、MiRNA-101表達水平檢測：在Microtube管中配制加入 LncRNA XIST、 MiRNA-101引物的總 RNA反轉錄反應混合液，變性和退火在 PCR機上在65℃下進行5min和4℃以獲得變性和退火的反應溶液。離心片刻后，將模板RNA /引物等的混合物收集在Microtube管底。將5×PrimeScriptTM緩沖液的逆轉錄反應溶液加入上述 Microtube管中，逆轉錄反應在 PCR機上在以下條件下于40℃進行15min或95℃進行5min，反應完成后4℃冷卻；使用PCR擴增試劑盒，將得到的cDNA分別加樣，上機行Real time-PCR反應，程序為：95℃預變性2min；95℃ 15s，60℃ 1min，循環45次；之后95℃變性1min，將其冷卻至55℃，記錄ct值以計算基因的相對表達量。

1.4 統計學方法 統計學處理使用Graphpad Prism7.0及SPSS22.0，測得數據以均數±標準差表示，無序數據采用χ2檢驗；等級資料及有序計數數據以頻數和百分比(%)表示，采用秩和檢驗：檢驗水準為α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織LncRNA XIST表達差異與臨床病理特征相關性 在本次研究收集標本中，LncRNA XIST表達量2-ΔΔct>1.5的有34例， LncRNA XIST表達量增高與腫瘤組織學分化具有負相關性(P<0.05)，與患者淋巴結轉移、神經脈管侵犯、腫瘤位置大小、浸潤深度及TMN分期等無關(P>0.05)。

2.2 胰腺癌組織MiRNA-101表達差異與臨床病理特征相關性 在本研究收集標本中，MiRNA-101表達量2-ΔΔct>1.5的有29例，MiRNA-101表達量增高與腫瘤的大小、浸潤深度及TMN分期具有負相關性(P<0.05)，與淋巴結轉移、神經脈管侵犯、腫瘤位置、腫瘤組織學分化等無關(P>0.05)。見表1。

表1 胰腺癌患者臨床病理特征與LncRNA XIST及MiRNA-101表達相關性

3 討論

迄今，胰腺癌其發病機理尚未徹底闡明，導致臨床治療常常舉步維艱，患者5年生存率非常低且發病率居高不下。胰腺癌的早期癥狀不明顯，且相當多的患者在就診時已進入晚期，失去最佳手術時機且長期預后不良[6]。因此，早期發現對于改善胰腺癌患者的臨床預后和延長生存期至關重要[7]。

LncRNA XIST是X染色體失活特異轉錄本(X-inactive specific transcript, Xist)，可以特異性地結合X染色體中的特定位點，介導X染色體失活[8-9]。目前已知MiRNA的序列結構在各個物種間具有高度的進化保守性[10]。MiRNA與下游靶mRNA的3’端非翻譯區相結合，從而調控靶基因的表達和相關分子信號通路的活性，參與胰腺癌細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程[11]。筆者認為胰腺癌的發生與原癌基因的失活到致癌基因的激活有關，再追溯到原癌基因中某一編碼基因的某個位點被沉默致使不再發揮編碼蛋白的作用， LncRNA XIST在其中發揮了至關重要的作用，從本次臨床相關性研究來看，腫瘤組織學分化低的標本與LncRNA XIST的表達密切相關，LncRNA XIST可能有助于胰腺癌的發展及更進一步的惡性程度轉變。更進一步分析，本次研究結果顯示MiRNA-101表達量高的標本其腫瘤浸潤深度及臨床分期均較樂觀，推測MiRNA-101可能是胰腺癌的抑癌基因，并為LncRNA XIST的靶基因之一，受LncRNA XIST的調控且抑制其在胰腺癌腫瘤組織中的表達，致使腫瘤組織更進一步的增殖、浸潤與轉移。本次研究并不能發掘LncRNA XIST、MiRNA-101之間是否存在相互關聯共同作用于胰腺癌，尚待進一步研究分析。然而，也許LncRNA XIST表達增高是胰腺癌分化不良的危險因素，MiRNA-101表達量降低是胰腺癌增殖、浸潤與轉移的危險因素。

綜上所述，LncRNA XIST和MiRNA-101在一定程度上與胰腺癌的分化和發展存在相關聯系，有望作為診斷性標志物和分子治療靶點而應用于臨床。