自體骨軟骨移植聯(lián)合富血小板血漿對兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的修復(fù)作用及機(jī)制*

熊隆江 李思云 黃曉蓬 劉華江

江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，江西省南昌市 330003

關(guān)節(jié)軟骨缺損是臨床常見就診病癥，可引起患者疼痛不適和關(guān)節(jié)功能障礙，最終導(dǎo)致退行性骨關(guān)節(jié)炎[1]。由于軟骨組織缺乏血管、軟骨細(xì)胞再生能力差，較大的軟骨缺損幾乎不可能自我愈合，因此手術(shù)干預(yù)成為治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的重要手段。目前臨床上常用的手術(shù)有軟骨成形術(shù)、軟骨下鉆孔術(shù)、微骨折術(shù)和骨軟骨移植術(shù)，而對于全層軟骨缺損或小面積脛骨間室軟骨缺損，自體骨軟骨移植可以短期內(nèi)緩解疼痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，故成為臨床上首選的治療手段，但自體骨軟骨移植存在軟骨來源有限、供區(qū)繼發(fā)病變等缺點(diǎn)[2]。近年來，生物學(xué)療法治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的價(jià)值引起了廣泛關(guān)注。富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)作為多種活性因子的載體，可以促進(jìn)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的修復(fù)，促進(jìn)周圍正常軟骨整合，延遲骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[3]。研究顯示[4-5]，氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的自由基可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解，與關(guān)節(jié)軟骨損傷關(guān)系密切。PRP促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)是否與氧化應(yīng)激有關(guān)，既往鮮有報(bào)道。本研究旨在探討自體骨軟骨移植聯(lián)合PRP對兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的修復(fù)作用及對氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 40只SPF級新西蘭大白兔由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，3～5月齡，雌雄各半，體重1.8～2.2kg。

1.2 方法

1.2.1 兔自體PRP制備:從兔耳耳根方向進(jìn)針，刺入兔耳中心靜脈，抽取5ml動脈血置于EDTA管中，做好標(biāo)記。采用二次離心法制備PRP。第1次離心轉(zhuǎn)速2 000轉(zhuǎn)/min，離心10min，離心后將下層紅細(xì)胞吸除，剩余部分再次離心，轉(zhuǎn)速2 000轉(zhuǎn)/min，離心10min，將血清層上方3/4部分吸除，剩余部分即為PRP。

1.2.2 動物模型制作:隨機(jī)將兔分為對照組、模型組、移植組、PRP組和聯(lián)合組，每組8只。用25%烏拉坦(4ml/kg)進(jìn)行麻醉，固定后用2%利多卡因進(jìn)行膝關(guān)節(jié)局部麻醉。分離后腿膝關(guān)節(jié)皮下組織，從髕骨內(nèi)側(cè)入路切開關(guān)節(jié)囊，在膝關(guān)節(jié)伸直位時(shí)將髕骨推至脫位，將膝關(guān)節(jié)屈曲，暴露股骨內(nèi)側(cè)髁。于股骨內(nèi)側(cè)髁建立全層軟骨缺損模型，用骨科電鉆鉆出直徑4mm、深度3mm的孔洞。清理缺損部位的組織碎屑和血塊后，在股骨髁非負(fù)重區(qū)取相應(yīng)直徑及深度的骨軟骨塊用于移植。對照組為健康兔，不做任何干預(yù)；模型組單純建立骨軟骨缺損模型；移植組將自體骨軟骨植入缺損處；PRP組用生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，將單純富血小板血漿植入軟骨缺損處；聯(lián)合組將PRP與自體骨軟骨復(fù)合體植入缺損處。兔干預(yù)后給予慶大霉素4萬U/d，連續(xù)3d，預(yù)防感染。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 組織病理學(xué)觀察[6]:干預(yù)8周后，用空氣栓塞法處死所有兔子，解剖出完整的膝關(guān)節(jié)，用4%甲醛固定24h，隨后用EDTA進(jìn)行脫鈣處理，5周后對標(biāo)本進(jìn)行脫水、包埋、切片。檢測時(shí)常規(guī)脫蠟，用PBS清洗切片，進(jìn)行蘇木精/伊紅(HE)染色，隨后用中性樹脂封片，MODEL CX41RF顯微鏡下觀察。根據(jù)國際軟骨修復(fù)學(xué)會(ICRS)組織學(xué)分級評分法評定并量化修復(fù)效果。

1.3.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測:干預(yù)8周后，從髕骨內(nèi)緣做縱行切口，分離關(guān)節(jié)囊，在關(guān)節(jié)液最集中部位用手術(shù)刀劃開關(guān)節(jié)囊，注入1.5ml生理鹽水，反復(fù)抽吸后抽出關(guān)節(jié)液。4℃15 000轉(zhuǎn)/min離心15min，取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測上清液中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)觀察 HE染色結(jié)果顯示，模型組的修復(fù)組織由一層非軟骨組織組成，缺損凹凸不平、關(guān)節(jié)面變形。移植組和PRP組均發(fā)現(xiàn)新形成的軟骨組織，新生的組織與周圍軟骨之間有明顯間隙。移植組缺損區(qū)中可見修復(fù)組織，表現(xiàn)為透明/纖維軟骨特征，另外可見許多活細(xì)胞呈簇狀分布。PRP組可見更多的纖維軟骨，細(xì)胞分布紊亂。聯(lián)合組可見相對平滑的透明樣軟骨，軟骨細(xì)胞柱狀排列，骨軟骨缺陷中填充的再生組織與正常透明軟骨和軟骨下骨整合,見圖1。

2.2 病理學(xué)評分 ICRS組織學(xué)分級評分如表1顯示，可見移植組、PRP組和聯(lián)合組的骨表面、軟骨礦化、基質(zhì)和細(xì)胞分布評分均高于模型組(P<0.05)，而細(xì)胞群和軟骨下骨的評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且聯(lián)合組軟骨礦化、基質(zhì)和細(xì)胞分布分級評分均高于移植組和PRP組(P<0.05)。

2.3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與對照組比，模型組關(guān)節(jié)液中GSH和SOD水平明顯降低，而MDA和8-OHdG明顯升高(P<0.05)。移植8周后，移植組上述指標(biāo)均未見明顯改善(P>0.05)，而PRP組和聯(lián)合組各指標(biāo)均明顯改善(P<0.05)。PRP組關(guān)節(jié)液中GSH和SOD水平明顯高于移植組，而MDA和8-OHdG水平低于移植組(P<0.05)。聯(lián)合組MDA水平明顯低于PRP組(P<0.05)，見表2。

3 討論

骨軟骨移植術(shù)是治療軟骨缺損的重要方法，但是該手術(shù)只能修復(fù)小范圍的軟骨損傷[7]。組織再生及修復(fù)時(shí)需要多種細(xì)胞因子參與，因此植入軟骨的同時(shí)若能加入生長因子，勢必會促進(jìn)骨愈合。但是目前市面上現(xiàn)有生長因子的種類均比較單一且價(jià)格昂貴，修復(fù)組織的效果也不甚理想[8]。PRP是經(jīng)過自體血獲取的血小板濃聚物，其含有的血小板數(shù)量是全血的3倍以上，血小板激活后可釋放多種生長因子，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和組織損傷愈合[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PRP可促進(jìn)移植的自體軟骨新生，并促進(jìn)其與周圍骨質(zhì)的緊密結(jié)合，進(jìn)而提高自體骨軟骨移植的療效[10]。本研究同樣顯示，聯(lián)合組修復(fù)軟骨缺損的效果優(yōu)于單獨(dú)自體骨軟骨移植。

圖1 移植后8周用HE染色法觀察再生軟骨的組織學(xué)表現(xiàn)

表1 四組ICRS組織學(xué)分級評分比較

注：與模型組比，①P<0.05；與移植組比，②P<0.05；與PRP組比，③P<0.05。

表2 不同組關(guān)節(jié)液中氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

注：與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與移植組比，③P<0.05；與PRP組比，④P<0.05。

PRP促進(jìn)骨缺損修復(fù)的機(jī)制主要包含以下3個方面：(1)血小板活化后分泌血小板活化因子，進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的釋放，這些細(xì)胞因子在啟動骨修復(fù)、刺激血管生成方面有重要作用[11]。(2)在凝血酶和鈣離子誘導(dǎo)下，或者創(chuàng)傷環(huán)境中，PRP中的血小板可以釋放α-顆粒，內(nèi)含血小板衍化生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、上皮細(xì)胞生長因子和胰島素樣生長因子等物質(zhì)，引起一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、分化和骨基質(zhì)形成[3]。(3)PRP中富含血管生長因子，利于局部血管生長，特別是在無細(xì)胞的人工骨移植的血管生成中。另外血管生長因子還有助于成骨細(xì)胞聚集和骨化[12]。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體遭受有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子產(chǎn)生過多，氧化程度超過氧化物清除能力，機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，進(jìn)而造成組織損傷[10]。關(guān)節(jié)軟骨損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而PRP與氧化應(yīng)激損傷的關(guān)系少有報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，血小板釋放的生長因子可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，并激活抗氧化反應(yīng)元件[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，PRP組和聯(lián)合組干預(yù)8周后，GSH和SOD水平明顯升高，而MDA和8-OHdG水平明顯下降，移植組干預(yù)前后氧化應(yīng)激指標(biāo)水平未見明顯變化，說明PRP可能通過改善氧化應(yīng)激而促進(jìn)軟骨修復(fù)，進(jìn)而提高自體骨軟骨移植的療效。

綜上所述，PRP能夠明顯改善關(guān)節(jié)氧化應(yīng)激損傷，可有效促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，有助于提高自體骨軟骨移植的療效。本研究的局限性為：(1)僅檢測了關(guān)節(jié)液中氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，未檢測血液中相關(guān)指標(biāo)的變化。(2)未從分子信號通路方面對氧化應(yīng)激損傷進(jìn)行評價(jià)，未來需要進(jìn)一步深入研究。