胡蜂蜂毒肽的固相合成

丁 靖, 趙 昱, 任 成, 張 煉, 胡婧雯, 方維臻, 陸 群*

(1. 西南交通大學，生命科學與工程學院，四川 成都 610031；2. 大理大學 云南省醫學昆蟲與蜘蛛資源開發利用重點實驗室，云南 大理 671000)

胡蜂又稱大黃蜂，其毒液含有大量的生物活性物質，經研究其具有潛在的生理學和藥理學活性[1-4]。其中具有代表性的成分就是有親脂親水性的陽離子活性肽——胡蜂蜂毒肽(Mastoparan)，該多肽含有14個氨基酸殘基，序列為COOH-Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu-NH2[5-7]。胡蜂蜂毒肽具有穿透細胞膜[6]，溶血[8-9]，抗菌[10-11]，抗病毒[12]，抗腫瘤[13-14]等廣泛的生物活性。因此，高效、快速、大量合成胡蜂蜂毒肽對研究其生物活性具有重要意義。

VILA-FARRéS X等采用固相合成法合成了胡蜂蜂毒肽[15-16]，但并未對其合成條件進行深入的研究。本文在此基礎上，采用Fmoc固相合成法，以Wang樹脂為載體，HBTU-HOBt為縮合劑，按照其氨基酸序列依次縮合，最終用切割試劑將其從樹脂上切割下來，得到粗肽，經RP-HPLC純化得到目標肽,純度97.6%。經HR-MS(EI)分析，確定該肽為胡蜂蜂毒肽(Scheme 1)。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-9100型紫外分光光度計；LC-6A型高效液相色譜儀；Agilent 6460型質譜儀。

Fmoc-Ile-Wang樹脂，上海吉爾化學有限公司；1-羥基苯并三唑(HOBt)，上海思域化工科技有限公司；苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU),上海思域化工科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 胡蜂蜂毒肽的合成

(1) 樹脂的活化

稱取2 g Fmoc-Ile-Wang樹脂(取代度SD=0.7 mmol·g-1)置于50 mL的固相合成管中，加入20 mL DCM溶脹30 min。后用DMF(4×1 min)沖洗，抽干待用。

(2) 脫樹脂保護

將20 mL 20%4-甲基哌啶/DMF加入固相合成管中，氮氣吹拌反應，重復操作兩次(1×5 min，1×30 min)。反應完畢分別以DCM(1×1 min)和DMF(1×1 min)交替沖洗4次。

(3) 脫保護效率的檢測

取5 mg脫保護的肽樹脂置于潔凈的玻璃試管中，加入檢測試劑A～C各2滴，于105 ℃加熱3 min，樹脂變為深藍(陽性)，表明脫保護完全。

(4) 第二個氨基酸的縮合

稱取2.51 g(4.2 mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH， 1.59 g(4.2 mmol)HBTU， 0.57 g(4.2 mmol)HOBt和1.46 mL(8.4 mmol)N,N-二異丙基乙胺(DIEA)于50 mL燒杯中，加入20 mL DMF溶解完全；加入脫保護的肽樹脂，室溫氮氣氛圍下反應2 h。縮合完畢，減壓抽濾，肽樹脂分別以DCM(1×1 min)和DMF(1×1 min)交替沖洗4次。

(5) 縮合效率的檢測

取5 mg(3)(4)步驟的肽樹脂置于玻璃試管中，加入檢測試劑A～C各兩滴，于105 ℃下加熱3 min，樹脂變為無色(陰性)，表明縮合完全。

表1 Fmoc-氨基酸投料比及用量

(6) 剩余氨基酸的縮合

重復(3)～(5)的步驟，按胡蜂蜂毒肽的序列，依次縮合剩余的氨基酸。若每次縮合完畢，樹脂檢測仍為陽性或弱陽性，需重復縮合，直至樹脂檢測為陰性。若重復縮合2～3次，樹脂檢測仍為弱陽性，無需重復縮合，加入封閉試劑乙酸酐/吡啶=1/1(V/V)以封閉未反應的氨基。胡蜂蜂毒肽的固相合成路線如Scheme 1，各氨基酸投料見表1。

(7) 樹脂的切割

將合成的肽樹脂抽干置于100 mL的圓底燒瓶中，加入40 mL切割試劑[三氟乙酸(TFA)/甲基苯基硫醚/H2O/苯酚/1,2-乙二硫醇=82.5/5/5/5/2.5,V/V/V/V/V]，室溫攪拌2 h。抽濾，濾液加入200 mL冰甲基叔丁基醚，析出大量白色固體沉淀，離心沉淀，棄掉上清液。沉淀物再加入5 mL冰甲基叔丁基醚，離心，重復5次，得到粗肽。

1.3 純化

將粗品肽用乙腈和水溶解，通過RP-HPLC純化，采用Welch Ultimate AQ-C18柱(250 mm×50 mm，15 μm)，流動相A為乙腈，B為水，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為215 nm。

2 結果與討論

2.1 表征

純化后的胡蜂蜂毒肽經HPLC分析，保留時間為8.54 min，純度為97.6%。經HR-MS(EI)分析發現740.70對應{[M+2H]2+}，1480.92對應{[M+H]+}。與該肽分子量1479.88相符，表明該肽為胡蜂蜂毒肽。

2.2 合成

(1) 樹脂溶脹試劑

在本次實驗中選擇Wang樹脂作為載體，在縮合之前，需要將樹脂充分溶脹，使樹脂上的活性基團充分暴露，提高縮合效率。本次實驗采用DCM、 DMF和DCM/DMF=1/1(V/V)三種溶劑對樹脂進行溶脹30 min(表2)。由實驗結果可知，DCM對Wang樹脂有更好的溶脹效果，因此本次采用DCM作為樹脂溶脹溶劑。

(2) 縮合劑

在固相合成多肽中，縮合劑的選擇也是影響縮合效率的關鍵因素，常見的主要有三種類型：碳二亞胺類，如N,N-二環己基碳二亞胺(DCC)；磷正離子類，如PyBoP；脲正離子類，如HBTU[17]。而碳二亞胺類縮合劑在多肽合成中易發生副反應，使肽鏈片段消旋化。而本次合成中我們采用HBTU-HOBt作為復合縮合劑，此縮合劑不僅可以提高縮合效率，每步縮合率達99.9%以上，同時加入HOBt也可以抑制消旋化反應。

表2 不同溶劑對樹脂的溶脹程度

(3) 反應溶劑

在合成過程中，反應溶劑對底物的溶解程度也會影響多肽的縮合效率。我們比較了DMF、 DCM和DCM/DMF=1/1(V/V)等3種溶劑對底物的溶解性，結果見表3。由表3可知，DMF和DCM/DMF=1/1(V/V)能夠完全溶解底物，而DCM只能使底物部分溶解。由于DMF可以完全溶解底物，DCM可以使樹脂溶脹，更好地暴露活性基團，從而可以更好地提高縮合效率。因此在此次合成中采用DCM/DMF=1/1(V/V)作為反應溶劑。

表3 不同溶劑對底物的溶解程度

(4) 氨基酸投料比

固相合成多肽時，每一步的縮合效率都會影響目標肽的純度及產率，因此需選擇適合的Fmoc-氨基酸投料比以提高縮合效率。在固相合成胡蜂蜂毒肽過程中，每一步縮合都以茚三酮顯色劑做定性檢測。結果顯示在縮合前10個氨基酸，僅加入3倍量的Fmoc-氨基酸，茚三酮檢測都為陰性，表明縮合率在99%以上。但發現隨著肽鏈的延長，其縮合效率會有所下降，需要加入5倍量的Fmoc-氨基酸才能得到99%以上的縮合率。

(5) 脫保護試劑

Fmoc基團是否徹底脫除直接影響下一步的縮合，進而影響最終多肽的純度，所以對脫保護試劑的研究非常重要。Fmoc基團在堿性條件下可有效脫除，通常采用20%哌啶/DMF作為脫保護試劑，但是哌啶為管制品試劑，難以購買。本次實驗我們研究了50%乙醇胺/DCM， 20%4-甲基哌啶/DMF和5%哌嗪/DMF三種脫保護試劑的脫除效率。采用Fmoc定量檢測方法測定脫保護效率[18]，該方法利用Fmoc基團在波長301 nm處具有很強的紫外吸收這一特點來計算脫保護的效率。結果如圖1，20% 4-甲基哌啶/DMF對Fmoc基團有更好的脫除效果，反應3 min，脫除率可達到80%；反應5 min，即可達到99.9%以上。綜上，本次實驗采用20% 4-甲基哌啶/DMF作為脫保護試劑。

t/min

采用Wang樹脂作為合成胡蜂蜂毒肽的載體，DCM作為樹脂溶脹溶劑，HBTU-HOBt為縮合試劑，DMF為反應溶劑，20%4-甲基哌啶/DMF為脫保護試劑，TFA/甲基苯基硫醚/H2O/苯酚/1,2-乙二硫醇=82.5/5/5/5/2.5(V/V/V/V/V)為切割試劑，經RP-HPLC純化，成功合成了胡蜂蜂毒肽。該方法具有操作簡單、重復性好、成本低等優點。