馬應龍麝香痔瘡膏中間體中煅爐甘石與冰片近紅外含量模型建立

宋僑，胡俊杰，白玉，鄭國華

(1.湖北中醫藥大學藥學院，中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室，湖北 武漢 430065；2.馬應龍藥業集團股份有限公司，湖北 武漢 430065)

馬應龍麝香痔瘡膏是治療肛腸疾病的一種常用軟膏制劑[1]，具有活血消腫、清熱燥濕、去腐生肌[2]等功效。該處方主要由人工麝香、人工牛黃、珍珠、煅爐甘石、硼砂、冰片、琥珀等7味藥組成，7種藥材粉末組成的中間體的含量高低將直接影響最終制劑的含量，因此，控制中間體的質量對于制劑質量具有極其重要的意義。《中國藥典》2015年版中馬應龍麝香痔瘡膏的含量測定是以煅爐甘石和冰片為檢測指標，常規的分析方法采用配位滴定法和氣相色譜法。但該方法操作煩瑣、費時費力，無法實現在生產過程中大量樣品的含量檢測。因此，尋找出一種快速、高效的質量分析方法具有重要意義。

近紅外光譜技術具有分析速度快、低成本、無樣品損耗[3-4]等優點，在藥物分析及藥品監督檢查領域[5]應用越來越廣泛。近年來，近紅外光譜技術在中藥領域的研究已有多項報道[6-7]，本研究嘗試利用近紅外光譜技術建立馬應龍麝香痔瘡膏中間體含量快速檢測模型。

1 儀器與材料

1.1 儀器 MPA傅立葉變換近紅外光譜儀(德國布魯克光學儀器公司)；萬分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；GC-2010氣相色譜儀(日本島津公司)；超聲波清洗器(廣東固特超聲股份有限公司)。

1.2 材料 三氯甲烷(批號：20160206)、鹽酸(批號：2015010607)、鉻黑T均購自上海凌峰化學試劑有限公司)；水楊酸甲酯(天津博迪化工股份有限公司)；0.05 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉標準溶液(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氨水(批號：20170605)、氯化銨(批號：20180505)、磷酸氫二鈉(批號：20180810)、三乙醇胺(批號：20140110)、環己烷(批號：20100105)、乙酸乙酯(批號：20140310)等均購自國藥集團化學股份有限公司；龍腦對照品(批號：110881-201508，含量96.8%)、異龍腦對照品(批號：111512-201603，含量96.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院；冰片、50 mL錐形瓶、50 mL容量瓶、50 mL分液漏斗、燒杯、漏斗、濾紙、去離子水、248批中間體粉末，中間體粉末由馬應龍藥業股份有限公司提供。

2 試驗方法

2.1 樣品制備 將總混合粉末按照馬應龍麝香痔瘡膏配方進行人為配比，只改變配方中煅爐甘石的配比比例，使其在配方中比例變化在常規比例的-15%、-14%、-13%……+13%、+14%、+15%，每個比例變化值用4個不同批次樣品配備，共配比124批粉末并混勻(150目)，編號a1～a124；按照相同步驟改變配方中冰片的配比比例，混勻，得到124批粉末編號b1～b124。

2.2 煅爐甘石含量測定 按照《中國藥典》2015年版馬應龍麝香痔瘡膏項下煅爐甘石含量測定方法，采用配位滴定法測量124批樣品中ZnO的含量。結果顯示，ZnO含量在49.7%～68.8%內與乙二胺四乙酸二鈉用量呈現良好的線性關系，回歸方程為Y=49.144X+0.006 2(R2=1.000 0)。每批樣品平行測量3次，取平均值作為ZnO含量參考值。

2.3 冰片含量測定

2.3.1 色譜條件與系統適應性試驗 色譜柱型號為DB-WAXETR毛細管柱(0.32 mm×30 m，1 μm)。進樣口溫度250 ℃，柱溫130 ℃，檢測器溫度250 ℃。分流比為10∶1。理論塔板數(以水楊酸甲酯峰計)為20 208，龍腦、異龍腦的分離度分別為12.828、15.788。對照品色譜圖見圖1。

2.3.2 內標溶液制備 取水楊酸甲酯適量，精密稱定，加環己烷-乙酸乙酯(1∶1)制成每1 mL含3 mg的溶液。

2.3.3 對照品溶液制備 分別稱取適量龍腦、異龍腦、冰片對照品，精密稱定，加入內標溶液制成每1 mL含2 mg的溶液。

2.3.4 供試品溶液制備 取已混合均勻的中間體粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入內標液10 mL，混勻，稱定重量，超聲處理15 min，放冷，在稱定重量，用環己烷-乙酸乙酯(1∶1)補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.3.5 含量測定 分別吸取龍腦對照品溶液與供試品溶液1 μL注入氣相色譜儀。依據對照品中龍腦的含量計算出供試品溶液中龍腦的含量，作為中間體粉末中冰片的含量。

2.3.6 方法學考察

2.3.6.1 線性關系考察 精密稱取龍腦對照品150.13 mg，置于25 mL容量瓶中，加入內標溶液溶解并稀釋至刻度線，搖勻，得到對照品溶液。從對照品溶液中分別吸取1、2、3、4、5 mL至10 mL容量瓶中，加內標液稀釋至刻度。上述6個濃度點以濃度為橫坐標，對照品峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標建立標準曲線。結果得龍腦回歸方程為Y=0.488 3X-0.015 5(R2=0.999 6)

說明龍腦在6.005 2～60.052 mg范圍內進樣量與對照品峰面積與內標物峰面積比值具有良好的線性關系。

2.3.6.2 精密度考察 精密稱取龍腦對照品2.06 mg加入10 mL容量瓶中稀釋至刻度，按照“2.3.1”項下色譜條件連續測定6次并計算校正因子。結果6次校正因子平均值為0.677 95，RSD值為0.32%。試驗結果表明本方法精密度較好。

A.冰片樣品;B.龍腦對照品;C.異龍腦對照品 1.龍腦;2.水楊酸甲酯;3.異龍腦

2.3.6.3 重復性考察 取其中一批配比的樣品(b64)，按照“2.3.4”項下平行制備6份樣品，按測定方法平行測定6份樣品中龍腦的含量，結果顯示龍腦的平均值為43.14 mg·g-1，RSD為0.71%，表明本方法重復性良好。

2.3.6.4 穩定性考察 在上述制備的6份樣品中隨機選取一份樣品，分別在0、2、4、6、12、24 h測定其含量，RSD為0.64%，表明所制樣品在24 h內穩定性良好。

2.3.6.5 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的中間體粉末(b2，龍腦含量35.12 mg·g-1)6份，每份0.5 g，分別加入17.5 mg龍腦對照品，按照制備供試品的方法制備樣品并測定回收率，結果見表1，結果表明本方法龍腦平均回收率為99.65%，RSD為0.58%，符合規定。

2.4 中間體粉末光譜采集 取以上所有中間體樣品約1 g，分別置于樣品測試杯中，在12 500～4 000 cm-1處掃描，分辨率為8 cm-1，掃描次數為32次，每個樣品重復測量3次，求得平均光譜用于分析。樣品光譜信息見圖2。

表1 加樣回收試驗結果(n=6)

2.5 樣本集的劃分 利用K-S方法[8]，將a樣品與b樣品分別劃分訓練集a與測試集a、訓練集b與測試集b。其中訓練集a共87份樣品，測試集a共37份樣品、訓練集b共86份樣品，測試集b共38份樣品。具體樣品信息見表2。

圖2 中間體近紅外光譜

表2 定量模型訓練集與測試集樣品信息

3 試驗結果

3.1 光譜預處理方法的選擇 近紅外光譜儀所采集的光譜除樣品的自身信息外，還包含了其他無關信息和噪聲，如電噪聲、樣品背景和雜散光等[9]。因此，需要對光譜進行預處理。矢量歸一化法(vector normalization,VN)可以消除微小光程差帶來的圖譜變動；導數處理可以校正基線并分辨重疊峰，多元散射校正可消除固體顆粒大小帶來的影響[10]。本試驗利用OPUS/QUANT-2定量分析軟件進行數據處理時，在全譜段范圍內對光譜進行矢量歸一化(VN)，一階導數(first derivative,FD)，二階導數(second derivative,SD),多元散射校正(multiple scatter correction,MSC)以及它們的組合[11]等對光譜進行預處理，并分別建立定量分析模型a(a樣品)與模型b(b樣品)，結果見表3。試驗過程中以模型的決定因子(R2)、內部驗證均方差(RMSECV)和相對分析誤差(RPD)綜合評價所建定量分析模型。其中R2越接近1，RMSECV 越小，說明建模性能越好。通常認為RPD>3，模型的預測精度高，如果RPD<2.5，需重新建立模型。

表3 全譜段范圍內用不同預處理方法建立的中間體粉末定量分析模型

由表3可知，對于中間體a(只改變配方中煅爐甘石比例樣品)，當采用一階導數(21點平滑)為預處理方法時，所建立的ZnO定量分析模型RMSECV值最小，R2值最大且RPD值最大，故選用FD(21點平滑)作為預處理方法。對于中間體b(只改變配方中冰片比例樣品)，當采用一階導數(25點平滑)與多元散射校正為預處理方法時，所建立的冰片定量分析模型效果最好，因此選用該方法作為預處理方法。

3.2 光譜特征譜段的選擇 在建PLSR定量分析模型時，為提高模型的預測能力和穩健性，常對光譜進行譜段篩選，區間偏最小二乘(iPLS)是將全譜等分成n個子區間，分別建立回歸模型，篩選出最佳譜段。本試驗將全譜段分別劃分為5、6、7、8、9、10個區間,不同區間下所篩選的最優譜段及模型的效果見表4。在“3.1”項下評價方法基礎上，同時利用測試集樣品進行外部驗證，以測試集驗證均方差(RMSEP)評價模型效果，其中R2越接近1，RMSEP越小表示模型預測能力越強。綜合考慮內部交叉驗證結果和外部驗證結果，確定最佳區間數和特征譜段。

由表4可知，對于a模型，當全譜段被劃分為6個區間，在12 493.3～11 073.9、8 246.6～6 823.3、5 411.6～3 999.9 cm-1，所建立的定量模型最優；對于b模型、全譜段劃分為10個區間，在9 947.6～8 246.6、7 398～5 697、4 852.3～3 999.9 cm-1，所建立的模型效果最好。因此選擇以上譜段作為相應定量模型的建模譜段。

3.3 模型評價與預測 在建立PLS模型時，主成分數對模型的預測能力有著極其重要的影響，主成分數過多會使得模型“過擬合”，過少則會“欠擬合”[12]，都會降低模型的預測能力。本研究以RMSECV作為優化參數來確定最佳主成分數(Rank值)，RMSECV與Rank值關系見圖3。模型參數確定后，用此模型對測試集樣品進行外部驗證，其分析結果見圖4。以模型預測值與參考值的相對偏差來評價模型的預測能力，對于a、b模型，平均相對偏差分別為1.27%、1.4%，表明兩個模型預測能力良好。

表4 劃分不同區間所建立的中間體粉末定量分析模型

圖3 訓練集樣品RMSECV與Rank值關系圖

圖4 外部驗證結果圖

4 討論

本試驗對中間體中煅爐甘石和冰片粉末的含量進行分析，所建立的分析模型可以準確快速地檢測未知含量的中間體中煅爐甘石與冰片的含量。在進行冰片含量測定時，由于實驗儀器原因并未采用藥典上的色譜條件，本試驗采用的方法經方法學考察表明該方法測定的冰片含量數據較為準確。由于試驗中所用的樣品數目有限，因此模型的適用性具有一定限制，日后隨著樣本數的增加，對模型不斷進行優化，模型的適應性將更加廣泛。