千山活血膏治療大鼠急性軟組織損傷的作用研究

陳瑤，王洪林，安莉君，曹慧玲，鄭國棟，郭遠強

(1.南開大學藥學院，天津 300350；2.哈爾濱商業大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076；3.北京修成藥業有限公司，北京 100085)

急性軟組織損傷是臨床骨科常見和多發疾病之一，一般是指由于外力間接或直接作用于人體，造成的局部組織腫脹或微小血管的壁破裂[1]。無菌性炎癥是急性軟組織損傷后發生的最重要的病理變化[2]，臨床上可以通過多種方式表現出損傷，包括局部腫脹、肌纖維斷裂、疼痛、皮膚青紫瘀斑和肢體功能障礙等。有研究表明，受損處出血會導致缺氧、缺血，引起組織細胞有氧呼吸破壞，影響細胞線粒體中氧化磷酸化過程，從而導致ATP生成減少或停止，引起軟組織損傷[3]。急性軟組織損傷嚴重影響人們的健康和工作能力，如不及時治療甚至可能導致患者自理能力受阻[4]，目前受到了越來越多研究者的重視。

中成藥千山活血膏(國藥準字Z20025596)是采用現代提取技術制備而成的攤于布上黑膏劑，由土鱉蟲、大黃、三七、延胡索、血竭、續斷、黃柏、乳香、沒藥、兒茶、細辛、千年健、山慈菇、澤瀉、山羊角、木香、白及、白芷、桂枝、羌活、紅丹、芝麻油共22味中藥制備而成。土鱉蟲、大黃、三七、延胡索、乳香、沒藥具有活血化瘀、舒筋活絡、消腫止痛的功效，千年健可壯筋骨、止痛和消腫。千山活血膏可廣泛用于肌膚關節腫脹、疼痛、活動不利，以及跌打損傷，腰、膝部骨性關節炎等癥狀者[5-6]。然而，目前還沒有千山活血膏治療急性軟組織損傷的報道。

本研究通過構建急性軟組織損傷大鼠模型，研究了千山活血膏用于治療急性軟組織損傷的療效及其作用機制，為千山活血膏廣泛推廣于臨床提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只雄性清潔級SD大鼠，體重(190 ± 10)g，均購于北京軍事科學院動物中心，實驗動物使用許可證號為：SYXK(津)2019-0001。所有大鼠均飼養于天津南開大學動物中心動物房，標準大鼠飼養籠(6只/籠)。飼養條件：人工照明(12 h光照/12 h黑暗)，相對濕度60%±10%，溫度(25±2)℃。所有大鼠均自由飲食和飲水。適應性飼養1周后用于后續實驗研究。

1.2 主要儀器 I2000型數字電子秤購于深圳市無限量衡器有限公司。JT-12S型自動組織脫水機購于武漢俊杰電子有限公司。BMJ-A型包埋機購于常州市中威電子儀器有限公司。HM525NX型石蠟切片機及MX35型超優刀片均購于賽默飛世爾科技公司。BX51型顯微鏡及DP70型照相系統均購于Olympus有限公司。LOGENE-I醫用圖像處理系統軟件及Digital Imagine數字圖像采集軟件2.1版均購于無錫市朗珈生物醫學工程有限公司。

1.3 藥品與試劑 千山活血膏由北京修成藥業有限公司提供；雙氯芬酸二乙胺乳膠劑/扶他林(進口H20160648)購于中美天津史克制藥有限公司；大鼠前列腺素E2(PGE2)酶聯免疫法試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司；大鼠白細胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫法試劑盒均購于武漢博士德生物科技有限公司；乙醇及二甲苯均購于國藥集團化學試劑有限公司；4%多聚甲醛、蘇木素及伊紅均購于湖北百奧斯生物有限公司。

1.4 急性軟組織損傷大鼠模型的建立 造模前1 d，用剃毛刀剃除所有大鼠左側臀部及大腿后側毛，而后使用8%的硫化鈉清除細小毛發，選擇大腿中部外側軟組織做好標記。所有大鼠用10%的水合氯醛進行全身麻醉，將大鼠左下肢平放，固定于急性軟組織損傷造模裝置操作平板上；然后使用50 g砝碼從100 cm高度空心管的頂部自由落體擊中大鼠左下肢軟組織，連續擊打3次，打擊部位出現面積約1 cm2的明顯皮下出血及腫脹。肉眼觀察，打擊后出現腫脹、青紫、瘀斑，但無皮膚破損；單側后肢跛行，但無骨折及脫位征，無其他異常情況發生，表明造模成功。

1.5 動物分組及給藥 用自制軟組織打擊器建立急性軟組織損傷大鼠模型，90只雄性SD大鼠隨機分為模型組，扶他林(0.5 g /只/天)組和千山活血膏(0.5 g /只/天)組，每組30只大鼠，每天給藥1次，連續15 d。造模后第1、4、7、15天分別記錄各組大鼠的活動狀態和體重。

1.6 指標檢測 分別取造模后的第1、4、7、15天各組大鼠損傷組織，加入9倍體積的PBS進行勻漿，離心取上清液，采用酶聯免疫法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、PGE2的含量變化，步驟嚴格參照酶聯免疫法試劑盒說明書進行。

1.7 病理組織學檢查 分別取造模后第1、4、7、15天各組大鼠固定后的肌肉組織，常規石蠟包埋，切片厚 4～5 μm，進行 HE染色，顯微鏡下觀察切片中組織出血情況、肌纖維以及炎性細胞浸潤。

采用盲評法[7-8]分別對造模后第1、4、7、15天各組大鼠軟組織損傷證候指數以及軟組織病理切片進行評分(見表1)。

表1 軟組織損傷評分標準

注：得分越高說明受損傷程度越嚴重

2 結果

2.1 千山活血膏對急性軟組織損傷大鼠活動及體重的影響 造模后第1天，3組大鼠均不活躍，跛足前行。造模后第4天，扶他林組與千山活血膏組大鼠腿部損傷有所好轉，活動較第1天稍有活躍，模型組無變化。造模后第7天，3組大鼠活動較為積極，模型組跛行明顯，扶他林組與千山活血膏組大鼠跛行不明顯。造模后第15天，模型組大鼠仍有部分跛行，扶他林組與千山活血膏組大鼠走動正常、活躍。

分別在造模后第1、4、7、15天記錄各組大鼠體重變化，如圖1。由此圖可看出，各組大鼠體重增長趨勢一致，軟組織損傷并未對大鼠體重造成影響，各個時間點3組大鼠體重差異均無統計學意義。

2.2 千山活血膏對急性軟組織損傷大鼠肌肉組織炎癥因子的影響 如圖2，與模型組相比，給藥4 d后扶他林組和千山活血膏組均未對幾種炎癥因子的表達水平造成影響。而給藥7 d和15 d后，扶他林組和千山活血膏組顯著降低了TNF-α和IL-1β的水平。對于PGE2，扶他林與千山活血膏無論用藥4 d，還是7、15 d均不能顯著降低PGE2的含量，3組之間PGE2的含量差異無統計學意義。

圖1 千山活血膏對急性軟組織損傷大鼠體重的影響

圖2 千山活血膏對急性軟組織損傷大鼠炎癥因子的影響(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

2.3 軟組織損傷癥候指數評分結果 軟組織損傷癥候指數評分，如表2所示，結果表明，造模后1 d，3組大鼠軟組織損傷癥候指數評分差異無統計學意義，用藥4 d后扶他林與千山活血膏均能顯著改善軟組織損傷，尤其是千山活血膏(P<0.01)。扶他林與千山活血膏差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 3組大鼠軟組織損傷癥候指數評分

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 3組大鼠損傷組織形態學觀察 分別取造模后第 1、4、7天損傷組織邊緣處新鮮肌肉組織，制備石蠟切片，HE染色后在顯微鏡下觀察組織病理學變化，如圖3。造模后1 d，3組大鼠肌肉組織切片均可見大量或灶性出血，炎性細胞擴散、浸潤，肌纖維間隙腫脹變形，組織溶解，細胞界限不清，肌纖維斷裂變性壞死。造模后4 d，模型組仍有部分的炎性細胞浸潤，兩給藥組可見炎癥細胞少量散在分布，組織水腫及出血較之前減輕；肌纖維間隙雖腫脹，但出血肌肉纖維斷裂壞死有所改善，肌纖維排列稍恢復。造模后7 d，模型組肌纖維排列紊亂，肌纖維間隙稍腫脹，較多炎性細胞浸潤，散在灶性出血。扶他林組和千山活血膏組損傷肌纖維變性、壞死、肌纖維間質炎性細胞浸潤的情況被顯著改善。造模后15 d，模型組仍見細胞間質出血，少量炎性細胞浸潤；千山活血膏組和扶他林組肌纖維間隙組織間液中基本未見炎性細胞，無毛細血管擴張、充血，無纖維斷裂情況，細胞間隙明顯，成纖維細胞增多。

圖3 千山活血膏治療急性軟組織損傷大鼠組織形態學變化(100×)

此外，我們對3組大鼠軟組織進行病理評分，如表3。造模后7 d和15 d，與模型組相比，扶他林組和千山活血膏組病理評分均顯著降低，這進一步表明了千山活血膏對損傷大鼠有良好的治療效果。

表3 3組大鼠軟組織切片病理評分

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

急性軟組織損傷作為一種常見的骨科疾病，以皮膚下組織，包括肌肉、韌帶、筋膜、肌腱、滑膜、脂肪、關節囊外周神經和血管，但不包括骨骼中的一系列急性挫傷或撕裂，為特征[9]。急性軟組織損傷通常由外力引起局部腫脹、疼痛、功能障礙和瘀傷等癥狀，其主要病理變化參與外傷性無菌性炎癥反應，以局部組織壞死、毛細血管擴張、白細胞浸潤、水腫和出血為表現。軟組織損傷屬于中醫學“筋傷”范疇，“氣滯血瘀、血溢脈外、脈絡不通”是傳統醫學對軟組織損傷的病機認識。如《瘍醫大全》所描述，“有跌傷骨傷，治法宜活血祛瘀為先，血不活則瘀不去，瘀不去則骨不能接也”。中醫外用藥常用于治療軟組織損傷，在我國歷史悠久，一方面價格低廉、使用方便；另一方面局部用藥，療效確切、藥力可直達病所。研究表明，藥物透皮吸收給藥具有避免肝臟的首過效應、避免對胃腸道刺激、延長有效作用時間、給藥方法簡單等優點[10]。因此，經皮給藥逐漸受到越來越多研究者的重視和青睞。

最近研究表明，急性軟組織損傷模型被廣泛用于研究眾多藥物的抗炎作用[11-12]。盡管其病因與臨床急性軟組織損傷的病因會有所差別，但其病理和臨床病理表現相似[11]。本研究使用50 g砝碼從100 cm高度空心管的頂部自由落體擊中大鼠左下肢軟組織，模擬臨床急性軟組織損傷的發生，建立急性軟組織損傷的大鼠模型，探究千山活血膏對急性軟組織損傷的治療效果。分析大鼠活動狀態及體重結果表明，軟組織損傷以及千山活血膏藥物的使用均并未對大鼠體重造成影響，千山活血膏卻能顯著改善急性軟組織損傷大鼠活動狀態。

現代醫學認為，機體受到損傷會引起游離神經末梢周圍組織產生充血水腫等炎癥反應。軟組織損傷會引起局部炎癥反應，釋放一系列炎癥因子、致痛性炎癥介質，可直接導致疼痛，炎癥局部的腫脹壓迫神經末梢也可引起疼痛。PGE2是重要的炎癥介質，能夠降低痛閾，在創傷中起重要作用[13]。TNF-α、IL-1β是兩個主要的促炎細胞因子，參與炎癥反應早期[14-15]。TNF-α能夠促進其他炎性細胞因子如IL-1β、IL-6等的產生，進而引起連鎖反應，使機體產生過度炎癥反應。IL-1β是炎癥反應中重要的促炎因子，未受到損傷時，IL-1β在體內的含量較低，當組織受到損傷時，IL-1β的含量急劇上升，因此血液及局部組織中的IL-1β含量可作為炎癥的嚴重程度的判斷標準。研究表明，中成藥三七活血片能顯著降低急性軟組織損傷大鼠組織PGE2含量[1]。中成藥金黃凝膠也能顯著降低急性軟組織損傷大鼠血清PGE2含量[16]。與前人研究不同，本研究3組之間PGE2的含量無統計學意義，本結果提示千山活血膏沒有介導炎癥因子PGE2參與急性軟組織損傷。分析其原因主要是因為膏藥黏在大鼠腿上，每日清理會對其造成一定的疼痛，導致PGE2含量變化不明顯。對于炎癥因子TNF-α、IL-1β，千山活血膏表現出與扶他林相同的抗炎消腫效果，與前人研究結果相似[16-18]。紀春梅等[19]研究表明扶他林治療急性軟組織疼痛取得良好的效果。本結果提示千山活血膏可能是通過調控TNF-α、IL-1β炎癥因子發揮作用，從而改善急性軟組織損傷。

此外，軟組織損傷癥候指數評分、組織病理學分析結果與組間TNF-α、IL-1β含量變化一致，也與前人研究結論一致[16,20]，以上有力地支持了我們的結論。造模后用藥7 d及用藥15 d，千山活血膏表現出與扶他林治療急性軟組織損傷相似的療效，千山活血膏組大鼠軟組織損傷癥候指數評分、組織病理學評分均與傷扶他組差異無統計學意義。本實驗也存在一定的局限性，雖驗證了千山活血膏對于大鼠的急性軟組織挫傷的治療機制可能是通過調節其炎癥因子，但并未確切的進行調節通路以及其他可能調節蛋白的研究。進一步檢測血液流變學等方面的指標，仍具有重要意義。

總之，本研究闡明了千山活血膏治療急性軟組織挫傷的可能機制，同時為千山活血膏臨床治療的療效以及治療周期提供了科學的依據。本研究表明千山活血膏對治療急性軟組織損傷具有較好的療效，其可能是通過調控TNF-α、IL-1β炎癥因子發揮作用，從而改善急性軟組織損傷。千山活血膏具有與扶他林相似的抗炎消腫效果，值得在臨床上推廣。