柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液中氨基酸的含量

鄧紅英，張永文，李永貴

(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院藥品調(diào)劑科，山東 濟(jì)南 250012;2.濟(jì)南市中心醫(yī)院藥劑科，山東 濟(jì)南 250014；3.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；4.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

復(fù)方氨基酸注射液(18AA)是一種含有合成人體蛋白質(zhì)所需要的18種氨基酸與其他輔料配制而成的滅菌水溶液，臨床上主要用于蛋白質(zhì)攝入不足以及吸收障礙等氨基酸不能滿足機(jī)體代謝需要患者的治療，也常用于改善手術(shù)后患者的營(yíng)養(yǎng)狀況[1]。由于氨基酸具有高極性、低揮發(fā)性、大部分無強(qiáng)發(fā)色基團(tuán)的特性，因此其分離和檢測(cè)都較為困難，目前常用的檢測(cè)方法有氨基酸分析儀檢測(cè)法、離子色譜法、柱前衍生高效液相色譜(HPLC)法等。方法存在儀器昂貴、運(yùn)行費(fèi)用高、衍生物不穩(wěn)定且有一定毒性、各組分分離效果差、樣品檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等諸多問題[2-7]。本研究建立了2，4-二硝基氟苯作為衍生化試劑[8-9]，高效液相色譜法檢測(cè)復(fù)方氨基酸注射液(18AA)中氨基酸的方法，該方法分離效果好，且重現(xiàn)性穩(wěn)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(LC-20AT型泵、SPD-M20A型檢測(cè)器，Lab solution液相色譜數(shù)據(jù)工作站，日本島津公司)；BT125D分析天平(Sartorius)；PHSJ-3F精密酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；超純水機(jī)(艾柯)。

1.2 試藥 門冬氨酸(批號(hào)：140691-200401，純度：100%)；谷氨酸(批號(hào)：140690-201203，純度：100%)；絲氨酸(批號(hào)：140688-201102，純度：100%)；甘氨酸(批號(hào)：140689-201605，純度：100%)；蘇氨酸(批號(hào)：140682-201302，純度：99.9%)；鹽酸精氨酸(批號(hào)：140781-200801，純度：100%)；脯氨酸(批號(hào)：140677-201507，純度：99.9%)；丙氨酸(批號(hào)：140680-201303，純度：99.9%)；纈氨酸(批號(hào)：140681-201202，純度：99.6%)；甲硫氨酸(批號(hào)：140684-201102，純度：100%)；胱氨酸(批號(hào)：140632-200502，純度：99.3%)；異亮氨酸(批號(hào)：140683-201302，純度：99.9%)；亮氨酸(批號(hào)：140687-201503，純度：99.9%)；色氨酸(批號(hào)：140686-201303，純度：99.9%)；苯丙氨酸(批號(hào)：140676-200405，純度：100%)；鹽酸組氨酸(批號(hào)：140693-200401，純度：100%)；鹽酸賴氨酸(批號(hào)：140673-201509，純度：99.9%)；酪氨酸(批號(hào)：140609-201513，純度：99.8%)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。復(fù)方氨基酸注射液(18AA)(自制中試品，批號(hào)：20160501、20160502、20160503)；2,4-二硝基氟苯(批號(hào)：201512271，純度99.0%，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈為色譜純；碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果[10]

2.1 溶液制備 配樣溶劑：pH 7.0磷酸鹽緩沖液。混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：精密稱取氨基酸對(duì)照品各適量，加水溶解，制成每1 mL中含有門冬氨酸62.45 μg、谷氨酸18.83 μg、絲氨酸25.11 μg、甘氨酸190.02 μg、蘇氨酸62.50 μg、鹽酸精氨酸125.02 μg、脯氨酸25.08 μg、丙氨酸50.06 μg、纈氨酸89.95 μg、甲硫氨酸56.25 μg、胱氨酸2.65 μg、異亮氨酸88.05 μg、亮氨酸122.15 μg、色氨酸22.50 μg、苯丙氨酸133.20 μg、鹽酸組氨酸62.52 μg、鹽酸賴氨酸107.58 μg、鉻氨酸6.30 μg的混合溶液。

混合對(duì)照溶液：精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 mL置10 mL量瓶中，加入5%碳酸氫鈉溶液1 mL與1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1 mL，搖勻，置60 ℃水浴，暗處加熱，間隔20 min振搖1次，60 min后取出，放冷，加磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)至刻度，搖勻。

供試品溶液：精密量取復(fù)方氨基酸注射液(18AA)50 μL置10 mL量瓶中，加入5%碳酸氫鈉溶液1 mL與1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1 mL，搖勻，置60 ℃水浴中，暗處加熱，間隔20 min振搖1次，60 min后取出，放冷，加磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)至刻度，搖勻。

空白溶液：按處方稱取除氨基酸外的各組分，加水配成空白對(duì)照溶液。精密量取空白對(duì)照溶液50 μL至10 mL量瓶中，照供試品溶液配制方法配制成空白溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為乙腈-水(60∶40)，流動(dòng)相B為乙腈-磷酸鹽緩沖液(0.014 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液pH 8.2)(9∶91)；流速1.0 mL·min-1；柱溫27 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣體積10 μL。梯度程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液10 μL注入液相色譜儀。記錄色譜圖及峰面積。試驗(yàn)結(jié)果表明，在本檢測(cè)條件下，空白溶液對(duì)氨基酸檢測(cè)無干擾，且18種氨基酸分離良好(見圖1)。

2.4 定量限與檢測(cè)限 精密量取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照溶液，加配樣溶劑稀釋，制成不同濃度梯度的溶液,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,分別取各溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計(jì)算各氨基酸的定量限與檢測(cè)限。

2.5 線性試驗(yàn) 精密量取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1、1.5、2、2.5、3 mL，分別置10 mL量瓶中，加入對(duì)應(yīng)比例的5%碳酸氫鈉溶液與1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液，搖勻，分別置60 ℃水浴，暗處加熱，間隔20 min振搖1次，60 min后取出，放冷，加磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)至刻度，搖勻，作為線性試驗(yàn)溶液，分別取上述各溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，以濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)做線性回歸，求得線性方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算RSD，結(jié)果各氨基酸峰面積RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算RSD，結(jié)果各氨基酸峰面積RSD均小于2%，說明混合對(duì)照品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密量取空白基質(zhì)50 μL置10 mL量瓶中，分別加入18種氨基酸對(duì)照品適量(約相當(dāng)于處方量的80%、100%、120%)，照“2.1”項(xiàng)下供試品配制方法配制成回收率試驗(yàn)溶液，平行配制3份。依法測(cè)定，計(jì)算平均回收率及RSD，結(jié)果見表3。

A.空白溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液 1.門冬氨酸；2.谷氨酸；3.絲氨酸；4.甘氨酸；5.蘇氨酸；6.鹽酸精氨酸；7.脯氨酸；8.丙氨酸；9.纈氨酸；10.甲硫氨酸；11.胱氨酸；12.異亮氨酸；13.亮氨酸；14.色氨酸；15.苯丙氨酸；16.鹽酸組氨酸；17.鹽酸賴氨酸；18.酪氨酸

表2 各氨基酸組分線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限與檢測(cè)限

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品檢測(cè) 取本品3批，照“2.1”項(xiàng)下方法制備混合對(duì)照溶液及供試品溶液，照“2.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)各氨基酸含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 衍生化條件選擇 本研究分別對(duì)衍生化試劑用量、衍生化溫度及衍生化時(shí)間進(jìn)行研究，結(jié)果使用1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1 mL，在60 ℃條件下衍生化1 h，樣品中各氨基酸均能衍生化完全，樣品檢測(cè)重復(fù)性好。

3.2 流動(dòng)相研究 本研究流動(dòng)相B為乙腈-磷酸鹽緩沖液(0.014 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液pH 8.2)(9∶91),9%的乙腈能防止流動(dòng)相長(zhǎng)菌、沉淀，延長(zhǎng)流動(dòng)相使用時(shí)間；磷酸鹽濃度對(duì)氨基酸的分離效果有改善作用；pH值8.2要求選用耐堿色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。

3.3 柱溫研究 本研究最佳柱溫為27 ℃，研究發(fā)現(xiàn)柱溫波動(dòng)對(duì)色氨酸與組氨酸分離影響較大，當(dāng)柱溫在(27±1)℃時(shí)，各氨基酸能較好地分離。

3.4 本檢測(cè)方法胱氨酸可以與其他氨基酸完全分離，但是由于其含量低，檢測(cè)濃度接近定量限濃度，因此含量測(cè)定時(shí)未做計(jì)算。