卡托普利：從多肽到小分子降血壓藥物的研發歷程

文雨，劉健，胡立宏

(南京中醫藥大學藥學院中藥功效物質重點實驗室，江蘇 南京 210023)

高血壓是一種以動脈血壓持續升高為主要表現的慢性疾病。目前臨床上高血壓主要分為兩大類：原發性高血壓和繼發性高血壓。其中原發性高血壓占高血壓患者90%以上，且發病機制尚不明確，可能與神經機制、腎臟機制、激素機制、血管機制、胰島素機制等密切相關。患者由于血壓升高，心臟需超負荷工作，以便泵送足夠的血液及氧氣來維持正常的身體機能。如果不及時治療，可能會導致心臟相關疾病，并伴隨腎臟損傷，危害大腦和眼睛等器官。據世界衛生組織報告，1980年全球有6億人患有高血壓，而2008年患病人數升高到10億，預計到2020年這一人數可能會達到15億[1]。在我國高血壓的患病人數也一直居高不下，因此抗高血壓藥物的開發具有巨大的社會及經濟價值。

人類對血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)作用機制的解析被認為是高血壓治療的重要突破。這一發現主要是基于對體內腎臟中的腎素-血管緊張素-醛固酮(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)系統的認識。RAAS是腎臟產生的一種升壓調節體系，腎素通常是由腎臟內的腎小球旁器官產生和分泌，以應對血壓下降或過濾后的氯化鈉濃度下降。一方面，分泌的腎素將肝血管緊張素原裂解成無活性的血管緊張素Ⅰ，然后通過ACE將血管緊張素Ⅰ轉化為活性的血管緊張素Ⅱ。血管緊張素Ⅱ有許多生理作用，其增加血管阻力，作用于腎上腺皮質釋放醛固酮，刺激后垂體釋放抗利尿激素加壓素，刺激口渴中樞，促進交感神經末梢去甲腎上腺素釋放，抑制去甲腎上腺素的再攝取。同時，血管緊張素Ⅱ也作為激動劑將其受體激活，從而引起一系列相應的生理變化，最終導致血管壁緊縮、血壓升高。另一方面，血管緩激肽本身是具有促進血管擴張、降低血壓的作用。而ACE可促進緩激肽的降解、失活，間接引起血壓的升高[2-3](見圖1)。

圖1 腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統對血壓的調節機制

血管緊張素轉化酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)可作為降壓藥物，其降壓原理主要是通過阻斷RAAS系統，抑制ACE 活性，從而抑制循環及局部組織血管緊張素Ⅰ轉化為血管緊張素Ⅱ，使血管緊張素Ⅱ生成減少，抑制緩激肽降解，從而具有舒張血管、降低血壓的作用[4]。卡托普利(商品名 Captopril)是第一代口服ACEI，其最初來源于巴西蛇毒中的一種緩激肽，能夠有效地治療各種原發性高血壓，具有起效迅速、降壓平穩、遠期療效突出等優點，同時對心力衰竭和糖尿病、腎病也有良好的治療效果。卡托普利的問世開啟了高血壓藥物治療的新時代[5-6]。時至今日，以卡托普利為代表的ACEI的研究，仍是藥物化學研究的熱點之一。盡管ACEI、鈣離子通道拮抗劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等各類抗高血壓新藥層出不窮[7]，但卡托普利仍在高血壓的臨床治療中扮演著重要的角色。

1 卡托普利的研發歷程

1.1 苗頭化合物teprotide發現 早在1933年，Rochae Silva發現被巴西蝮蛇咬傷的患者會因為低血壓休克而死亡，由此猜想蛇毒中應該含有一種“降壓物質”。直到1948年，Rochae Silva終于成功地從巴西蝮蛇的蛇毒中提取出這種“降壓物質”，并通過結構鑒定，確證該物質是一種直鏈的九肽化合物，命名為“緩激肽(bradykinin,簡稱BK)”。BK只有在蛇毒體內才能穩定存在，在人體內的半衰期極短，僅幾分鐘便會完全分解。因此，研究人員猜測毒蛇體內可能存在一種穩定BK的生源物質，于是對生源物質展開了研究。

1960年，Ng和Vzne發現巴西蛇毒中含有一種“緩激肽增強因子(bradykinin potentiating factor,簡稱BPF)”，同時，研究結果表明，BPF可在一定程度上抑制緩激肽降解酶，從而減緩緩激肽的降解[8-9]，并且發現該化合物可與體外制備的血管緊張素轉化酶反應，最終發現了有效的血管緊張素轉化酶抑制劑。基于此研究結果，Ferreira等[10-12]先后從蛇毒提取液中分離得到不同的緩激肽增強因子，并且報道了這些長肽的氨基酸序列的合成。綜合比較幾種多肽后，發現五肽BPP5a對ACE抑制活性最好，但其體內的半衰期非常短。而九肽SQ20881(teprotide)抑制活性僅次于BPP5a，但卻擁有相對較長的體內半衰期(T1/2=2.5 h)。

隨后Vandongen和Greenwood[13]兩位科學家開展了teprotide對腎灌注大鼠和異丙腎上腺素刺激腎素分泌的大鼠的影響。研究發現，減小teprotide的用量時，相關的大鼠血壓升高，表明在腎中血管緊張素Ⅰ被轉化為血管緊張素Ⅱ。另外，血管緊張素Ⅰ的轉化也會影響腎素分泌和對異丙腎上腺素的刺激反應。最終隨著teprotide臨床試驗的不斷推進，研究人員確證teprotide是一種有效的ACEI，但因為它是一種大分子肽類化合物，存在肽類藥物的缺點，如：透膜性差、生物利用度低、只能通過注射給藥，從而限制了其在臨床上的使用。

1.2 先導化合物1的確定 為了克服肽類藥物的缺點，該類藥物研發的重點開始轉向可口服的小分子ACEI的開發，研究策略主要是探究teprotide的藥效團，簡化化合物結構，降低分子量，提高成藥性。由于該多肽是大分子，可能具有一定程度的二級或三級結構，使其與ACE的活性位點之間進行特異的結合。生物學的研究發現血管緊張素與羧肽酶A均為肽類外切酶，這兩種酶在序列上具有45.2%相似性，而當時羧肽酶A相較血管緊張素的研究較為充分，羧肽酶的蛋白結構已被成功解析，并且已有相關的羧肽酶A抑制劑報道。但由于當時計算機輔助藥物設計技術并不成熟，研究人員也無法基于羧肽酶的結構去對血管緊張素進行同源模建，獲得血管緊張素的蛋白結構，研究人員無法基于ACE的蛋白結構進行化合物設計。因此，Cushman和Ondetti只能先探討teprotide與羧肽酶A活性位點可能的相互作用模式，用來指導teprotide的結構優化[14]。

羧肽酶A中正電性的Arg145與teprotide中C-末端負電性的芐基琥珀酸形成靜電相互作用，同時羧肽酶A中疏水性氨基酸與底物中的苯環形成的疏水相互作用(見圖2)。此外，羧肽酶A的Zn2+與底物的羰基相互作用，并促進該位點的酰胺鍵水解。盡管血管緊張素轉換酶與羧肽酶A的活性位點非常類似，但其中也存在一定的差異[15]：①對于羧基靜電相互作用區以及Zn2+結合區之間的距離，ACE大于羧肽酶A，因此在ACE中，Zn2+可能參與N-末端倒數第二個氨基酸水解，而非最后一個肽鍵的水解(見圖3)；②ACE及羧肽酶A中與底物疏水側鏈結合的疏水口袋差別較大，ACE為圓形，羧肽酶A為六邊形口袋(見圖2a、2b)；③在血管緊張素轉化酶的活性位點上存在氫鍵供體與底物的羰基形成的氫鍵相互作用，羧肽酶A并無該氫鍵作用；以上的蛋白與小分子結合作用差異，證明ACE抑制劑不同于羧肽酶抑制劑，ACE抑制劑至少應具有二肽的結構單元。

Cushman和Ondetti綜合分析苗頭化合物teprotide和BPP5a的結構、BPF的構效關系以及受體與配體的結合模式，得到了關鍵酶結合底物Ⅰ(substrate Ⅰ)。Ⅰ有以下特征：①化合物C端的脯氨酸處于ACE的結合口袋，對整個化合物的活性至關重要，是關鍵的藥效基團，負電性羧基不僅與靶蛋白中正電性Arg145殘基形成靜電相互作用，同時脯氨酸側鏈還伸入疏水空腔中，與靶蛋白形成疏水作用；②與脯氨酸相連接的丙氨酸，則通過與靶蛋白形成氫鍵相互作用，而發揮抑制活性。但該底物對ACE的抑制活性較弱，IC50僅為600 μmol·L-1，因此該化合物仍需進一步活性優化。

Cushman和Ondetti進一步參考了羧肽酶A和其抑制劑的結合模式，并模擬ACE與底物Ⅰ的結合方式，經過生物電子等排設計得到先導化合物1，該化合物對ACE具有一定的抑制活性(IC50=330 μmol·L-1)。

圖2 a.羧肽酶A活性結合位點；b.血管緊張素轉化酶活性結合位點

圖3 脯氨酸藥效團、底物Ⅰ、先導化合物1的發現

1.3 先導化合物1的結構優化 先導化合物1盡管活性仍較差，但從結構上已經較之前的九肽簡化很多，以此為先導進行結構優化，有望發現新型的ACEI。通過前期對ACE的作用機制研究，發現ACE的活性中心會有5個結合位點。為了獲得活性及理化性質更優的候選藥物，Cushman和Ondetti對先導化合物1的5個結合位點分別進行了結構優化，設計、合成了一系列新的衍生物。

1.3.1 ACE正電活性位點和疏水空腔的結合基團優化 通過對該作用位點的結構分析，發現配體基團伸入ACE的結合口袋，一般是以氨基酸取代最優。因此，Cushman和Ondetti設計了一系列不同氨基酸取代的衍生物，期望能夠獲得活性更優的化合物(見表1)。

表1是不同氨基酸殘基取代后的活性結果：從整體來看，疏水性越強的氨基酸進行取代，活性越好。結果顯示：脯氨酸取代的活性最好，可能由于脯氨酸的五元雜環與疏水口袋更加疏水結合更強，將脯氨酸替換為其他氨基酸殘基反而會降低化合物活性；另外比較L構型和D構型的脯氨酸和苯丙氨酸，發現L構型抑制活性遠優于D構型，表明L構型氨基酸更易與ACE正電活性位點，形成更好的空間匹配與能量契合。

表1 不同氨基酸殘基取代對ACE的抑制活性數據

注：*使用的是兔血管緊張素轉化酶

1.3.2 依據與活性中心的Zn+的螯合作用進行結構優化 ACE的活性位點結構和羧肽酶A較為類似，依據芐基琥珀酸與羧肽酶A的結合特點，芐基琥珀酸會與活性中心Zn2+進行螯合，而該配位鍵作用相比氫鍵作用、疏水作用以及范德華作用更強，因此該配位鍵作用較為重要。因此，與ACE活性中心Zn2+形成配位的基團對整個化合物的活性至關重要。于是，Cushman和Ondett對該作用位點的基團進行一系列的替換，主要是引入Zn2+形成配位鍵的基團，如：-COOH、-SH、磷酸基團等，相關化合物結構和活性對應關系如表2所示。

表2 不同基團和Zn離子結合的活性數據

注：*使用的是兔血管緊張素轉化酶

活性測試結果表明，該部分的取代基對化合物活性影響較大。磷酸基團取代的化合物15較先導化合物1，體外酶活性提升了40倍左右；而巰基取代的化合物13比先導化合物1的體外酶活性提高了約1 600倍左右。表明巰基和活性位點的Zn離子結合最好，磷酸次之，羧酸和Zn離子結合效果最差，后期的結構優化主要以巰基為主。

1.3.3 脂肪鏈長度對活性影響 考慮到脂肪鏈的長度一方面直接影響整個化合物的理化性質，另一方面影響巰基與Zn2+的相互作用以及C-末端脯氨酸與Arg的靜電相互作用、疏水相互作用。因此，研究人員對該位置的脂肪鏈長度進行延長或縮短，期望能夠進一步增強化合物與相互作用，從而提高化合物活性(見表3)。

表3 不同脂肪鏈長度的活性數據

注：*使用的是兔血管緊張素轉化酶

表3活性數據結果顯示，當碳原子數為1和2時，活性較優，對體外酶抑制活性分別為1.1和0.2 μmol·L-1。而當碳原子數小于1或者大于2后，化合物活性顯著降低。因此，研究人員繼續以化合物13作為先導化合物，進行結構優化。

1.3.4 脂肪鏈上取代基優化 由圖2可知，化合物的9位與ACE活性位點之間可能存在相互作用。另外，結合底物Ⅰ的結構，發現該位點之前有甲基取代。于是，研究人員在脂肪碳鏈的8位和9位分別引入甲基，繼續研究化合物的構效關系(見表4)。

表4 脂肪鏈上引入不同取代基的活性數據

注：*使用的是兔血管緊張素轉化酶

表4活性測試結果表明，當9位有甲基取代，化合物22活性降低。當8位引入甲基，S構型的化合物21較化合物13活性降低；但是，R構型的化合物20較化合物13活性提高了10倍左右。說明8位引入R構型的甲基更易與ACE的活性位點相互作用。

1.4 卡托普利上市及后續進展 最后，研究人員開展了化合物20(卡托普利)對腎臟高血壓大鼠和正常血壓大鼠的體內藥效學實驗(見圖4)，發現卡托普利對腎高血壓大鼠具有非常好的降壓效果，而對正常血壓大鼠并沒有明顯影響[5]。再結合之前不同衍生物對ACE酶水平的抑制活性研究，研究人員正式將卡托普利作為候選藥物，并于1977年全面開始臨床研究，1981順利獲得FDA批準上市，成為首個上市的普利類ACEI[16]。

隨著默沙東研發團隊對卡托普利上市后的持續關注，發現巰基的引入帶來了強療效的同時也帶來了許多副作用，例如皮疹、瘙癢以及味覺障礙等。于是，研究人員將卡托普利上的巰基直接用羧基替換，再對結構進行優化，最后發現用α-羧基苯丙胺取代時活性最好，其改善了與活性中心的親和力，即依拉普利拉(Enalaprilat)。但是，依拉普利拉的口服生物利用度太差，半衰期短(T1/2=0.5 h，F%<10%)。研究人員通過前藥設計的概念，將依拉普利拉的羧基做成單乙酯，提高了脂溶性，也就是現在的依拉普利(Enalapril)(二甲酸類)，并在1985年被FDA批準上市。依拉普利具有較優的透膜性，易吸收(T1/2=11 h，F%=68%)，在體內水解成羧酸再游離出來，從而發揮降血壓的作用，成為繼卡托普利后又一治療高血壓的重磅藥物。隨著藥物化學家們對普利類藥物的繼續研究，又相繼設計了許多不含巰基的二甲酸類藥物，包括如：雷米普利(Ramipril)、貝那普利(Benazepril)等新產品。這些普利類藥物都表現出優良的降血壓效果，為高血壓病人戰勝疾病帶來了福音。

圖4 從卡托普利到其他普利類藥物的開發過程

2 總結

縱觀卡托普利的研發歷程可謂是一路波折，最初從蛇毒中發現導致低血壓的緩激肽，再到從蛇毒中分離出緩激肽的穩定劑九肽活性化合物teprotide。臨床試驗發現teprotide的確是有效的ACEI，由于它是一種肽類分子，口服生物利用度低，限制了其在臨床上的應用。然后，研究人員以化合物teprotide為基礎，探討ACE與其抑制劑可能的結合模式，設計出先導化合物1；進一步對先導化合物1的5個結合位點官能團的結構優化，成功得到了第一個口服類小分子ACE抑制劑卡托普利(Captopril)。卡托普利的研發過程匯聚了藥物學家們的智慧與汗水，其成功經驗對肽類苗頭化合物的研發具有重要參考價值。