熒光定量PCR基因檢測對G6PD缺乏癥的診斷價值探討

王亨莉，鐘志娟 (中山大學附屬第五醫院，廣東 珠海 519001)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏癥是世界上最常見的紅細胞酶病。目前統計，約有4億人口存在G6PD缺陷。本病常見于瘧疾高發區、地中海貧血和異常血蛋白病等流行地區出現，地中海沿岸、東南亞、印度、非洲和美洲黑人的發病率較高[1]。我國分布規律呈“南高北低”的態勢，長江流域以南，尤以廣東、海南、廣西、云南、貴州、四川等地為高發區，發生率為4%～15%，個別地區高達40%[2]。該病是由于調控G6PD的基因突變所導致的，是X連鎖不完全顯性遺傳，G6PD是紅細胞糖代謝戊糖磷酸途徑(包括GSH代謝途徑)中的一種重要酶類，其主要功能是生成潛在抗氧化劑紅細胞還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，后者為維持谷胱甘肽還原狀態所必需[3]。G6PD基因異常表達會導致紅細胞糖代謝戊糖磷酸途徑代謝異常，NADP不能轉變成NADPH，后者不足則使體內的兩個重要抗氧化損傷的物質GSH及過氧化氫酶(CAT)不足，從而血紅蛋白和紅細胞膜均易于發生氧化性損傷[4]。臨床表現為溶血性貧血或蠶豆病。因此，尋求更方便、快捷的診斷方法有利于臨床上及時治療G6PD缺乏癥的患者。目前，臨床上常見的診斷手段有高鐵血紅蛋白還原法、熒光斑點試驗、硝基四氮唑藍紙片法[5]。高鐵血紅蛋白還原法簡便快捷，但特異性較差，熒光斑點試驗敏感性和特異性較高，但不夠快捷，硝基四氮唑藍紙片法特異性較差[6-9]。因此，尋找一種簡便快捷、特異性高、靈敏度好的檢測方法有重要意義。本研究旨在探究熒光定量PCR對于G6PD缺乏癥患者的診斷價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取本科室自2018年1月～2018年10月接收的100份血樣(陰性標本和陽性標本各50份)，入選本研究的血樣均應符合以下的納入排除標準：納入標準：①陽性血樣提供者經診斷是G6PD缺乏癥患者；②陰性血樣提供者為健康正常人，無任何血液系統疾病；③血樣提供者BMI值在18.4～28.6 kg/m2范圍內。排除標準：①有先天性心臟病或其他血管疾病；②患有惡性腫瘤的患者；③有肝腎疾病的患者；④有其他血液系統性疾病的患者。其中，陽性標本提供者(n=50)男28名，女22名，年齡6～42歲，平均為(28.9±3.2)歲；陰性標本提供者(n=50)男25名，女26名，年齡8～38歲，平均為(28.1±3.5)歲。陰性標本和陽性標本提供者的一般資料包括性別、年齡、BMI等比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器及試劑：賽默飛ABI熒光PCR儀；AU5800系列全自動生化分析儀；高鐵血紅蛋白還原實驗MHBR試劑(0.0004M美蘭和2.5%NaNO等比例混合)；測定G6PD改良版試劑盒；TaqMan探針(美國Nova公司)；Taq酶(美國APE BIO公司)；引物(上海芯超生物科技有限公司)；QIA amp DNA Blood Mini Kit(上海芯超生物科技有限公司)。

1.3高鐵血紅蛋白還原法： 取新鮮的靜脈血0.9 ml，加入肝素抗凝劑0.1 ml,充分混勻，低速離心10 min，取出后調整血細胞和血漿的比例為1∶1后再次混勻，得到抗凝血。用移液槍移取上述抗凝血50 μl，并加入高鐵血紅蛋白還原實驗MHBR試劑50 μl，充分混勻，在恒定溫度37 ℃條件下放置3 h，后取出加入4.9 ml蒸餾水，混合均勻，2 min后，即會顯色。若顏色為呈鮮紅色者，則是正常情況；若顏色呈棕色、紫色或者棕紅色則是缺乏G6PD。顏色與血紅蛋白的還原率有關，正常人還原率≥75%，對于G6PD缺陷癥患者來說，高鐵血紅蛋白還原率降低，所呈現的顏色便不同[10-12]。

1.4熒光定量PCR：首先用QIA amp DNA Blood Mini Kit來提取得到DNA，若不能及時進行PCR，則應先儲存在-20 ℃冰箱中。之后應根據文獻查閱的該DNA可能存在的5個突變位點設計引物(由上海芯超生物科技有限公司合成)。然后混合的以下PCR反應體系：2 μl DNA；1 μl引物；2 μl Taq酶;1 μl TaqMan探針；4 μl 5X Prime script Buffer 2。設定PCR程序是85 ℃預變性 515 min；85 ℃ 20 s，4 ℃ 10 μ，共30個循環；65 ℃ 30 s采集熒光信號。在賽默飛ABI熒光PCR儀分析數據[13-14]。

1.5統計學分析：本研究所得所有數據及資料均使用SPASS 19.0軟件進行統計學分析，對數據及資料進行t檢驗，主要是得到數據的置信區間及數據是否有統計學差異。導入數據樣本，執行“分析-比較均值-單樣本t檢驗”，一般設定置信區間為95%，確定之后分析得結果，觀察P值，P>0.05時，差異無統計學意義：當P<0.05時，數據間存在的差異才有統計學意義。

2 結果

觀察組的特異性、靈敏度、陰性預測值、陽性預測值、診斷符合率均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 觀察組與對照組結果比較

3 討論

G6PD缺乏癥是一種遺傳病，發病率高，尋找有效快速方便的檢測手段對于臨床治療至關重要。本研究表明，熒光定量PCR是一種很好的檢測手段，比臨床傳統的高鐵血紅蛋白還原法有高特異性、高靈敏度、高陰性預測值、高陽性預測值和高的診斷符合率。因此，熒光定量PCR可作為診斷 G6PD缺乏癥的新型技術手段在臨床上推廣[15]。但目前該技術尚存在局限性，如基因突變位點需要進行篩查并合成相關引物，前期工作重大，但筆者認為，隨著醫學技術的不斷發展，該技術所需的基因突變位點和相關引物會不斷完善。