探討Foxa2基因表達(dá)對小鼠心臟房間隔缺損的影響

張 猛，武玉華，孫曉棟，潘金勇 (石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，新疆 石河子 832008)

德朗熱綜合征(Cornelia de Lange Syndrome,CdLS)是一種表現(xiàn)為多系統(tǒng)發(fā)育障礙的遺傳性疾病，據(jù)相關(guān)研究目前認(rèn)為該疾病主要與常染色體顯性遺傳以及X-連鎖兩種遺傳方式，通常會(huì)表現(xiàn)為生長發(fā)育的障礙、上肢及手部畸形、精神發(fā)育遲滯、行為的異常以及心臟間隔的缺損。在總?cè)巳褐邪l(fā)病率為1∶10 000，該疾病的發(fā)生對患者的生活質(zhì)量以及家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)造成嚴(yán)重影響。2004年Tonkin等發(fā)現(xiàn)Nipped-B相似基因(Nipped-B-like，NIPBL)突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳CdLS[1]，Kawauch等人報(bào)道了NIPBL+/-攜帶單倍體NIPBL基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在E17.5-E18.5，有接近一半NIPBL+/-胚胎發(fā)現(xiàn)有巨大的房間隔缺損，心室和心室肌的異常也被發(fā)現(xiàn)[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Foxa2這些基因在心臟和內(nèi)臟器官發(fā)育過程中扮演重要角色，該基因的主要功能是調(diào)節(jié)內(nèi)胚層發(fā)育，F(xiàn)oxa2基因表達(dá)顯著下調(diào)后，會(huì)出現(xiàn)心臟的間隔缺損[3]。本研究旨在研究NIPBL+/-小鼠模型中房間隔缺損的形成與Foxa2基因表達(dá)關(guān)系。為CdLS的診斷和干預(yù)提供新的策略。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:對照組為6只雄性NIPBL+/+小鼠子代。實(shí)驗(yàn)組為6只雄性NIPBL+/-小鼠子代，由北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)嚴(yán)格按照石河子大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)定，光照時(shí)間控制在12/12 h ，溫度(21±2)℃。

1.2主要試劑:熒光定量PCR試劑盒(Qiagen 公司，德國)，cDNA合成試劑盒(Thermo-fermentas 公司，美國)。

1.3體重測量：分別測量小鼠4周后時(shí)體重。每只反復(fù)測量三次保證數(shù)值準(zhǔn)確性。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR )檢測小鼠心臟組織Foxa2的mRNA水平:①于4周后取出小鼠心臟。②用Trizol 法提取心臟組織的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop 2000)測量總RNA的濃度與純度，當(dāng)260 nm/280 nm在1.8～2.0范圍內(nèi)時(shí)，按照cDNA合成試劑盒(Thermo-fermentas 公司，美國)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。③Foxa2基因引物設(shè)計(jì)、合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物序列為：上游引物：5′- TCCGACTGGAGCAGCTACTAC -3′，下游引物：5′- GCGCCCACATAGGATGACA -3′；β-Actin上游引物：5′- CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC -3′，下游引物：5′- TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT -3′。④采用熒光定量PCR試劑盒(Qiagen 公司，德國)在64孔 ABI Prism7300 序列檢測系統(tǒng) (美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參基因與目的基因各重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)3個(gè)陰性對照，建立總體積為20 μl的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃，2 min(1個(gè)循環(huán))；95℃，5 s ；60℃， 30 s(40個(gè)循環(huán))，循環(huán)結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，30 s，60℃，15s后得到溶解曲線。

2 結(jié)果

2.1兩組小鼠生長發(fā)育比較:兩組小鼠體重在4 w時(shí)相比，實(shí)驗(yàn)組體重(35.03±2.94)顯著小于對照組體重(43.19±2.57)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05,t=6.027。見圖1。

圖1 兩組小鼠4周時(shí)體重比較

2.2兩組小鼠心臟組織中Foxa2 mRNA表達(dá)：小鼠心臟組織中Foxa2 mRNA的表達(dá)相比實(shí)驗(yàn)組為4.14±4.07，與對照組的9.67±6.73比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3 討論

CdLS是一類少見的累及多器官系統(tǒng)與遺傳有密切關(guān)系的先天性疾病，其中生長發(fā)育遲緩以及先天性心臟病(Congenital Heart Disease，CHD)是公認(rèn)的特征。而CdLS患者的死亡原因與其先天性器官發(fā)育異常有密切關(guān)系，其中并發(fā)CHD的患者，死亡率可高達(dá)15%。在CHD的患者當(dāng)中又可表現(xiàn)為法洛四聯(lián)征、單心室等畸形，但以室間隔和房間隔缺損是最為常見的[4]。在相關(guān)研究顯示NIPBL突變引起的CdLS不是染色體分離異常引起，而是 Nipbl和Cohesin復(fù)合物對由于基因表達(dá)調(diào)節(jié)的異常造成的[5]。Chatfiel等人發(fā)現(xiàn)Foxa2基因在心臟和內(nèi)臟器官發(fā)育過程中扮演重要角色，該基因的主要功能是調(diào)節(jié)內(nèi)胚層發(fā)育，當(dāng)Foxa2表達(dá)顯著下調(diào)后，會(huì)出現(xiàn)心臟的間隔缺損[3]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，NIPBL+/-小鼠子代在生長發(fā)育過程中體重明顯低于NIPBL+/+小鼠子代，這可能是由于NIPBL+/-小鼠子代基因表達(dá)以及分子蛋白結(jié)構(gòu)的表達(dá)異常造成，在兩組小鼠的心臟房間隔處的Foxa2基因表達(dá)中，實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組，這可能是由于實(shí)驗(yàn)組NIPBL基因的缺陷導(dǎo)致Foxa2基因表達(dá)降低，從而引起房間隔的缺損。本研究中全部選用雄性小鼠，主要是避免雌性鼠在其性周期中因雌激素水平變化而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，NIPBL+/-基因缺陷鼠中Foxa2基因表達(dá)降低，在一定程度上導(dǎo)致小鼠生長發(fā)育遲緩，體重下降，可能是造成小鼠心臟房間隔缺損的原因，本實(shí)驗(yàn)通過探討Foxa2基因表達(dá)對小鼠心臟房間隔缺損的影響，為先天性心臟病的診斷和干預(yù)及降低出生病患率提供了新的思路。