郁金根乙醇提取液對KM小鼠慢性肝損傷的研究

張旭冉，劉悅俠，韋柳姿，麥洪華，林禮浩，辛文成，藍 妮，李曉彤，李 津，姜 艷，梁凌玲 (.右江民族醫學院臨床醫學院,廣西 百色 5000;.右江民族醫學院科技處實驗動物中心,廣西 百色 5000;.右江民族醫學院科學實驗中心,廣西 百色 5000；.右江民族醫學院科技處，廣西 百色 5000)

慢性肝炎是由諸多因素引發的一組肝病癥狀，將會對患者的機體健康與正常生活造成嚴重的不良影響,因此需要采取有效的藥物進行治療[1]。目前臨床醫師主要使用干擾素治療,能夠獲得顯著的治療效果[2],但經過諸多臨床實踐可知,干擾素會在較大程度上導致患者產生不良反應[3]。很多慢性肝炎是由于長期的(大于6個月)肝損傷得不到有效的治療造成的。郁金的功效為活血止痛，行氣解郁，利膽退黃，且可以涼肝降氣，故在肝病治療中運用十分廣泛[4]。根據實驗用四氯化碳(CCl4)溶于食用油建立慢性肝損傷動物模型[5]。筆者借鑒其方法，通過實驗得出腹腔注射4%的CCl4造模效果最佳，在小鼠死亡率為零的基礎上，提高了造模率。張婉嫻等用郁金水煎液對CCl4急性肝損傷小鼠模型灌胃給藥,發現郁金可影響凋亡基因53和capase-3蛋白的表達、阻礙肝細胞凋亡，對CCl4致小鼠急性肝損傷有一定的保護作用[6]。故筆者在此基礎上檢測郁金根提取液對慢性肝損傷小鼠MAPK信號通路中p38的表達量的影響。

1 材料

1.1儀器：RE-3000A 型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，ALPHA1-2 /LD-Puls 型冷凍干燥機(德國 CHRIST),FA1104 型電子分析天平(上海天平儀器廠),DHG-9070A 型電熱恒溫旋風干燥箱(上海精密設備有限公司),HHS-21-4型電熱式恒溫水浴鍋(江蘇金壇宏凱儀器廠),SHB-Ⅲ型循環水真空抽氣泵(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2藥品：CCl4，郁金根(采于廣西百色市郊),南京建成：谷草轉氨酶測試盒(C010-2-96T)、 谷丙轉氨酶測試盒(C009-2-96T)，阿拉丁Fenofibrate ≥98%(F129682)，Solarbio：Tris-甘氨酸電泳液(T1070)、高效RIPA裂解液及配件PMSF(R0010)，Thermo 彩虹蛋白marker(26616)，碧云天：BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型P0010S)、 SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0012AC)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(P0015)、 QuickBlockTMWestern封閉液(P0252)、QuickBlockTMWestern二抗稀釋液(P0258)、QuickBlockTMWestern一抗稀釋液(P0256)，BeyoECL Plus(超敏ECL化學發光試劑盒P0018S)。

1.3動物:雄性SPF級昆明(KM)小鼠，體重22±2 g。由湖南天勤公司提供，生產許可證號：SCXK(湘)2017-0011。

2 方法

2.1分組：取72只雄性小鼠，按隨機原則分成六組，每組12只，分別標記為空白組、模型組、陽性對照組、郁金高濃度組、郁金中濃度組、郁金低濃度組。

2.2造模：將CCl4與食用油按4∶100的比例配成4%的CCl4溶液，除了空白組外的所有組小鼠腹腔注射4%的CCl4溶液進行造模，空白組注射0.9% NaCl溶液，按照10 ml/kg，每3天注射一次，連續造模8周，出現腹水。每組隨機抽取2只小鼠進行AST和ALT的檢測，可以檢測出注射4%的CCl4溶液的小鼠的AST和ALT比空白組的明顯升高，說明造模成功。

2.3郁金根乙醇提取液的制備:將新鮮的郁金根用清水洗凈，陰干，粉碎至粉末。稱取郁金根干粉100 g，按料液比 1∶10加入85%的乙醇溶劑，按下述方法進行提取。75℃恒溫水浴加熱回流提取2次，每次2小時，抽濾，合并濾液，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至25 ml(相當于生藥4 g/ml)，4℃保存，給小鼠灌胃時用0.9% NaCl溶液分別配制成2 g/ml、1 g/ml的藥液。

2.4給藥方法:按照空白組(0.9% NaCl)、模型組(0.9% NaCl)、陽性對照組(0.02 g/ml Fenofibrater溶液)、郁金高濃度組(4 g/ml郁金根提取液)、郁金中濃度組(2 g/ml郁金根提取液)、郁金低濃度組(1 g/ml郁金根提取液)給藥，按小鼠的體重計算灌胃量(10 ml/kg)，1次/d，常規喂養，連續觀察14 d，此期間小鼠腹水逐漸減少，無死亡。

2.5檢測:

2.5.1對所有組的小鼠進行眼球采血，冰上靜置2 h，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，用谷草和谷丙轉氨酶試劑盒檢測AST和ALT的變化值。

2.5.2小鼠肝臟蛋白用Western blot檢測p38表達量,曝光p38目的條帶，用ImageJ軟件對曝光的條帶的相對灰度值進行計算并統計。

3 結果

3.1郁金根乙醇提取物對小鼠血清ALT和AST的影響：6組之間兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)，與空白組相比，模型組的AST/ALT活性顯著升高(P<0.05)，郁金高、中、低濃度組的AST/ALT活性顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、郁金高、中、低濃度組的AST/ALT活性顯著降低(P<0.05)；與陽性對照組相比，郁金高、中、低濃度組的AST/ALT活性顯著降低(P<0.05)。結果見表1。

表1 郁金根乙醇提取物對小鼠血清ALT和AST的影響

注:與空白組相比，①P<0.05;與模型組相比，②P<0.05；與陽性對照組相比，③P<0.05

3.2不同組別的p38表達Western blot結果：見圖1。6組之間兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05),與空白組相比，模型組的p38的表達量顯著升高(P<0.05)，郁金高、低濃度組的p38的表達量降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、郁金高、中、低濃度組的p38的表達量降低(P<0.05)；與陽性對照組相比，郁金高、中、低濃度組的p38的表達量降低(P<0.05)。結果見表2。

注：A.空白組；B：模型組；C：陽性對照組；D：郁金高濃度組；E：郁金中濃度組；F：郁金低度組圖1 不同組別小鼠p38蛋白Western印跡結果圖

表2 不同組別小鼠肝臟p38蛋白的表達量

注:與空白組相比：①P<0.05，與模型組相比，②P<0.05;與陽性對照組相比，③P<0.05

3 討論

在中醫上，郁金作為活血化瘀藥物，常常與其他藥物配伍用于治療各種肝臟疾病[7]。藥物性肝炎是指使用一種或多種藥物之后，由藥物或其代謝產物而引起的肝臟損傷，隨著新藥品的增多，其發病率呈上升趨勢，對此中西結合療效顯著[8]。

多項研究表明通過服用中藥制劑、靶向治療或者基因敲除的方法可以抑制MAPK信號通路的p38的磷酸化，從而抑制TNF-α和IL-1β的產生，對肝臟損傷起到保護作用[9-14]。通過p38MAPK調控p65 來激活凋亡執行蛋白 Caspase-3是溫郁金二萜類化合物C發揮抗炎和抗癌可能的作用機制之一[15]。

本實驗結果表明，模型組中血清AST/ALT和肝臟p38含量比正常組升高，說明CCl4導致正常小鼠血清AST/ALT升高及MAPK信號通路中的p38上調。而經過郁金治療后，小鼠血清AST/ALT、肝臟p38含量有所下降，其中降低血清AST/ALT以高濃度郁金最有效、肝臟MAPK信號通路中p38的下調以中濃度郁金最有效。

綜上所述，郁金根乙醇提取液對慢性肝損傷小鼠的治療機制可能與降低血清AST/ALT和肝臟MAPK信號通路中p38的下調有關。