分子模擬研究殼聚糖-氮化硼納米管封裝及輸運阿霉素

李嘉辰，俞斌，王琦，張麗

（1 浙江大學化學系，浙江杭州310029； 2 浙江理工大學理學院，浙江杭州310018）

引 言

納米管材料由于具有空腔管體結構、能跨越生物體的多重屏障等特點，被廣泛地應用于藥物輸運的研究[1-4]。相比于碳納米管（CNTs），氮化硼納米管(BNNTs)由于具有較高的化學穩定性和良好的生物相容性，在藥物輸運領域受到廣泛的關注[3-6]。例如，Li 等[5]報道由BNNTs 構建的薄膜可以改善人類原代乳腺成纖維細胞和轉化的乳腺細胞系的增殖。Chen 等[6]研究發現，BNNTs 能作為載體將寡聚DNA輸運到細胞內部并且沒有發現BNNTs 具有明顯細胞毒性。現有研究結果表明BNNTs 在藥物輸運系統中存在潛在應用前景。

然而由于BNNTs 具有較大比表面積和較高化學穩定性，BNNTs 常通過π-π 堆積的方式聚集且難于分散，限制了其應用[7]。有效提高BNNTs的分散性對于將BNNTs 應用于藥物輸運領域具有重要意義。由于殼聚糖及其衍生物在低pH 溶液中顯示出生物降解性、細胞膜黏附性和易質子化等優點[8-11]，通過引入殼聚糖及其衍生物可以進一步提高BNNTs 的分散性和生物相容性[11]。此外由于生物系統中的pH 水平不同（例如，癌細胞周圍pH 較低[12-13]），質子化殼聚糖還能夠與某些腫瘤細胞表面的多糖受體結合，提高載體的有效靶向性[14]。殼聚糖及其衍生物可作為pH 敏感載體將藥物分子遞送到靶細胞中[15-17]。因此，殼聚糖-BNNTs 復合載體在藥物輸運領域存在潛在的應用前景。

近年來，分子動力學模擬（MD）的方法可以在原子及分子水平提供許多現階段實驗還無法觀測的信息，從而為解釋藥物靶向輸運機制和載體材料分子設計提供依據[18-20]。本課題組在之前利用MD 研究結果表明，殼聚糖與BNNTs 的作用方式受到殼聚糖骨架上官能團以及BNNTs 管徑大小的影響。非質子化殼聚糖可以通過BNNTs 管徑調節快速自發地進入BNNTs 管中，而質子化殼聚糖由于周圍有序水化層，會影響進入管中的動力學過程[20]。這為利用殼聚糖封裝藥物進入BNNTs 提供理論依據。本文主要通過MD 方法，以抗癌藥物阿霉素DOX 為藥物模型，揭示利用殼聚糖-BNNTs 復合載體材料封裝及輸運抗癌藥物的可行性。該研究將為基于BNNTs 的藥物載體材料的設計與應用提供理論指導及依據。

1 模擬方法

1.1 模型及力場構建

如圖1所示，通過替換多糖上的—OH，構建2種10 聚的殼聚糖模型：完全脫乙酰化的殼聚糖（—NH2chitosan,CS_A10）以及完全脫乙酰化且質子化的殼聚糖(—NH3+chitosan, CS_B10)。功能化基團參數包括非鍵參數及殼聚糖單元之間的成鍵參數，鍵連、角度、二面角等參數來自Ferreira 等[21]的工作。非鍵參數通過Gaussian03 軟件[22]，采用HF/6-31G+的方法，分別優化2 種含不同官能團（—NH2和—NH3+）殼聚糖單體結構得到。

圖1 10聚殼聚糖模型，由替換多糖—OH獲得（所有原子以licorice模型顯示）Fig.1 Initial structure of chitosan with 10 units was generated by replacing glucose unit—OH group into—NH2 and—NH3+groups,respectively

阿霉素(doxorubicin,DOX)是一種常用廣譜抗癌藥物。本文以DOX 為藥物模型，揭示利用殼聚糖-BNNTs 輸運抗癌藥物的可行性。DOX 電荷通過Gaussian03軟件[22]，采用HF/6-31G+的方法獲得。

結合本課題組之前殼聚糖BNNTS 復合材料的研究，本工作探討利用BNNT (14,14)封裝殼聚糖和DOX 的可行性。如圖1(c)所示，BNNT(14,14)模型通過VMD 軟件nanotube-build 模塊構建[23]。BNNT(14,14) 使 用AMBER-GAFF 力 場，其 中BNNT (14,14) 電荷以及LJ 作用參數來自Aluru 等[24]的工作。BNNT(14,14)中硼和氮原子電荷參數分別為+0.300和-0.300；LJ 參數包括sigma (nm)和epsilon (kJ/mol)分 別 為 硼 原 子：0.337 和0.602；氮 原 子：0.345 和0.393。

棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,POPC)常用于模擬細胞膜磷脂雙分子層。磷脂雙分子層的結構文件以及AMBER-GAFF 力場形式POPC 的力場文件由lipidbook 網站下載。磷脂雙分子層由上下2×256個POPC組成。

1.2 模擬細節

1.2.1 殼聚糖-BNNTs 封裝DOX 殼聚糖-BNNTs封裝DOX的模擬初始構型截圖如圖2(a)所示。首先獲得了CS_A10/DOX 的構型。然后將CS_A10/DOX 的構型放置在BNNT(14,14)管口，進行殼聚糖-BNNTs封裝DOX 的模擬。模擬系統置于9 nm × 9 nm× 17 nm 的水盒子當中，水分子采用TIP3P 模型。模擬過程采用周期性邊界條件，模擬步長為2 fs。采用PME的方法[25]計算靜電作用并且范德華作用截斷半徑為1.2 nm。通過Lorentz-Berthelot 的方法[26]計算不同原子之間的LJ 作用勢。模擬中通過velocity rescaling 方法[27]控制溫度為300 K，并且將BNNTs 固定住。模擬系統先進行5000 步的能量優化然后進行較長時間的NVT模擬。

圖2 殼聚糖-BNNTs封裝(a)及跨膜輸運(b)DOX的初始構型截圖（CS_B10殼聚糖為licorice模型，POPC為line模型，BNNT為licorice模型，DOX為vdW模型；截圖中沒有顯示水分子和反離子）Fig.2 Initial structure of encapsulation(a)and transmembrane transport(b)of DOX by chitosan-BNNT(14,14)

1.2.2 殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運DOX 人體腫瘤細胞環境pH 較低，殼聚糖在低pH 條件下易質子化。Thomas 等[28]報道BNNTs 能自發嵌入并穩定存在于磷脂雙分子層中。為研究癌細胞環境利用殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運DOX，如圖2(b) 所示，將得到的穩定CS_A10/DOX/BNNT 構型替換為完全質子化狀態的CS_B10/DOX/BNNT 構型，并且將CS_B10/DOX/BNNT 的構型部分嵌入到磷脂雙分子層之中。殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運DOX 時，模擬盒子大小為10 nm×10 nm×12 nm。

1.2.3 平均力勢（potential mean of force，PMF）自由能計算 通過umbrella sampling 方法[29]計算一個單元—NH2殼聚糖與BNNT (14,14)以及DOX 與BNNT(14,14)之間的PMF。PMF 計算時，施加距離限制。以BNNT (14,14)為中心，反應路徑為—NH2殼聚糖/DOX 與BNNT(14,14)之間的質心距離。質心距離限制時，簡諧勢力常數為3000 kJ/(mol· nm2)。采樣窗口間隔距離為0.05 nm，一條完整PMF 曲線采樣共計60 個窗口。其中，每個窗口進行10 ns 的分子動力學模擬，取數據后5 ns 用于PMF 分析。PMF 分析時，采用WHAM 方法[30]去除額外施加的諧振勢的影響。

2 實驗結果與討論

2.1 殼聚糖-BNNTs封裝DOX

BNNTs 由于具有空腔管體結構，能跨越生物體的多重屏障等特點，被廣泛地應用于藥物輸運的研究領域[3-4,6]。利用BNNTs 空腔管體結構，將抗癌藥物封裝到BNNTs 管道中可以提高抗癌藥物利用率并有效降低其毒副作用。模擬進行前將CS_A10/DOX 的構型放置在BNNT(14,14)管口，通過分子動力學模擬探討殼聚糖-BNNTs 封裝DOX 的可行性。如圖3所示，30 ns瞬時構型圖中可以看出，CS_A10殼聚糖與DOX能完全進入管中。圖3中統計CS_A10殼聚糖/DOX 與BNNT(14,14)質心距離隨時間的變化。可以看出，模擬5 ns 內殼聚糖/DOX 與BNNT(14,14)之間的距離迅速下降，最后在0 左右波動。結果表明，殼聚糖-BNNTs 復合載體能夠迅速封裝DOX，存在潛在的應用前景。

如圖4 所示，計算一個單元—NH2殼聚糖與BNNT (14,14)以及DOX 與BNNT (14,14)之間的PMF，進一步研究DOX 封裝過程。—NH2殼聚糖以及DOX 從管口2 nm 到管中心0 nm 時,進入管中的自由能逐漸降低。也可以發現，一個單元—NH2殼聚糖以及DOX 穿過管中心的自由能分別為-11 和-56 kJ/mol。自由能結果表明，殼聚糖以及DOX 存在進入管中的趨勢。更多單元的殼聚糖進一步提供進入管中的驅動力。然而本課題組最近研究發現[20]，質子化殼聚糖需要很長時間才能進入管中。盡管自由能有利于質子化殼聚糖進入管中，但BNNT 管中[圖5(a) Ⅰ所示]以及質子化殼聚糖周圍存在的有序分布水化層，會影響殼聚糖進入的動力學過程以及封裝效率。DOX 尺寸較大，類似質子化殼聚糖也會影響進入動力學過程。為此，如圖5 所示，通過牽引不同固定取向DOX 進入管中，進一步分析所施加外力隨時間的變化。可以發現當DOX共軛環相對xy面水平（horizontal）進入管口后，牽引力出現明顯峰值且遠大于以豎直（vertical）方式進入管中。表明DOX 需要調整構象才能進入管中。圖3(b)中也顯示，殼聚糖攜帶DOX 進入管中時，能夠吸附固定且調整DOX 以合適的角度進入管中。因此，殼聚糖攜帶DOX 進入管中時，殼聚糖存在特殊優勢：一方面能提供進入驅動力，另一方面能調整DOX以合適構象進入管中。

圖3 (a)CS_A10殼聚糖/DOX與BNNT(14,14)質心距離隨時間的變化；(b)體系初始以及30 ns 瞬時構型圖Fig.3 (a)Center of mass(COM)distance between CS_A10/DOX and BNNT(14,14)versus simulation time;(b)snapshot of system at 0 and 30 ns

圖4 一個單元—NH2殼聚糖與BNNT(14,14)以及DOX與BNNT(14,14)之間的PMF（坐標0為管中心位置，虛線為管口位置）Fig.4 Potential of mean force(PMF)of—NH2 and DOX passing through BNNT(14,14)[The reaction coordinate is along the central axis of BNNTs.0 nm is the middle location of the tube and the dotted lines represent the end location of BNNT(14,14)]

圖5 (a)Ⅰ:BNNT(14,14)管中水的xy平面密度分布圖；不同取向DOX的初始構型，Ⅱ:DOX共軛環相對xy面豎直（vertical）放置；Ⅲ:水平（horizontal）放置；(b)牽引不同取向DOX進入管中所施加外力隨時間的變化（牽引速率為0.01 nm/ps，虛線表示管口位置）Fig.5 (a)Ⅰ:Density map of water molecules in BNNT(14,14)in xy plane;DOX with different orientations in xy plane,Ⅱ:vertical;Ⅲ:horizontal;(b)external force on DOX versus simulation time[the pull rate is 0.01 nm/ps and the dotted lines represent the end location of BNNT(14,14)]

2.2 殼聚糖-BNNTs跨膜輸運DOX

為實現殼聚糖-BNNTs 復合載體在藥物輸運領域的應用，從分子水平理解殼聚糖-BNNTs 復合載體材料與生物體及藥物之間相互作用具有重要的意義，而細胞膜是生物體中藥物輸運過程的重要屏障。基于此本文探討了殼聚糖-BNNTs 復合載體跨膜輸運DOX 過程的可行性。跨膜輸運DOX 時，考慮到腫瘤低pH 環境，選擇將CS_A10/DOX/BNNT 構型，替換為完全質子化狀態的CS_B10/DOX/BNNT構型。

從圖6 所示的瞬時構型圖可以發現BNNT (14,14)管隨模擬時間增長不斷陷入并最終完全進入到磷脂雙分子層（POPC）中。圖7(a)為POPC/CS_B10殼聚糖/DOX 與BNNT(14,14)質心距離隨時間的變化。BNNT (14,14)管與POPC 的距離最初為2.5 nm。隨著模擬時間的不斷增長，BNNT(14,14)管與POPC 的距離不斷下降，10 ns 后下降到并最終穩定在0 nm左右。即BNNTs 能穩定存在于POPC 中，該結果與Thomas 等[28]研究結果較好吻合，他們指出BNNTs 能自發嵌入并穩定存在于磷脂雙分子層中。此外從圖6 所示的瞬時構型圖中不難發現，隨著模擬時間的不斷增長，CS_B10殼聚糖從管中逐漸脫離并最終穩定吸附于POPC 表面。DOX 也由BNNT (14,14)管底部最終上升到管頂部。圖7(a)也顯示CS_B10殼聚糖/DOX與BNNT(14,14)管中心的距離快速上升。

圖6 殼聚糖-BNNTs復合載體跨細胞膜輸運DOX的瞬時構型圖Fig.6 Snapshot of transmembrane transport of DOX by chitosan-BNNT(14,14)

圖7 (a)POPC/CS_B10殼聚糖/DOX與BNNT(14,14)質心距離隨時間的變化；(b)CS_B10殼聚糖/DOX/PO與BNNT(14,14)相互作用能隨時間的變化（PO表示單個進入管中的POPC分子）；(c)BNNT(14,14)管中隨時間的模擬細節截圖（虛線為POPC的中心位置）Fig.7 (a)COM distance between POPC/CS_B10/DOX and BNNT(14,14)versus simulation time;(b)interaction energy between CS_B10/DOX/PO and BNNT(14,14);(c)snapshot in BNNT(14,14)(the dotted line is the center of POPC)

圖7(c) 為BNNT (14,14)管中過程細節圖，隨著BNNT(14,14)管不斷陷入POPC 中，2 ns 左右管中進入一個完整的磷脂分子。而隨著磷脂分子的進入，由于管中空間有限，CS_B10殼聚糖以及DOX 被不斷向上排擠。為驗證這一結果，分別統計CS_B10殼聚糖、DOX 以及PO（進入管中的磷脂分子）與BNNT(14,14)相互作用能隨時間的變化，結果如圖7(b) 所示。從圖中可知PO與BNNT(14,14)相互作用最強，即磷脂分子能穩定存在于BNNT(14,14)管中。此外POPC 與BNNT (14,14)的較強疏水作用使得BNNT(14,14)不斷陷入POPC中，管中磷脂分子因而能不斷向上逐漸排擠CS_B10殼聚糖以及DOX。而隨著CS_B10殼聚糖不斷被擠出管中，CS_B10殼聚糖與BNNT(14,14)相互作用逐漸減弱為0，CS_B10殼聚糖完全脫離BNNT (14,14)管，DOX 上升到BNNT (14,14)上方。該結果表明，殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運阿霉素時，管中吸附物質能被細胞膜磷脂分子擠出或者存在離開管中趨勢。這為后續實驗設計提供思路：即可以提高管中封裝藥物濃度，當跨膜輸運時，藥物可以被磷脂分子擠出，進一步提高腫瘤部位給藥濃度。

3 結 論

本文采用分子動力學模擬方法，對殼聚糖-BNNTs復合載體封裝以及跨膜輸運DOX 進行研究，得到以下結論。

（1）PMF 自由能顯示DOX 以及非質子化殼聚糖存在自發進入管中趨勢，通過施加力變化分析發現DOX 以不同構象進入管中難易程度不同。結果表明，非質子化殼聚糖能提供DOX 進入管中驅動力，并吸附且調整DOX 以合適的構象進入管中。

（2）殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運阿霉素時，相互作用能結果顯示，細胞膜磷脂分子與BNNT (14,14)管存在較強的相互作用，磷脂分子能自發嵌入到BNNT (14,14)管中。管中吸附物質能被細胞膜磷脂分子擠出。這為后續實驗設計提供思路，即可以提高管中封裝藥物濃度，當跨膜輸運時，通過磷脂分子擠出藥物來進一步提高腫瘤部位給藥濃度。