Epstein-Barr病毒感染相關性肝損傷對循環血T淋巴細胞亞群影響的相關性分析

戢敏，陳星，喻雪琴，陳芳，梅怡晗，梅小平

（1.川北醫學院附屬醫院 感染科，四川 南充 637000；2.首都醫科大學，北京 100069）

Epstein-Barr 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種經呼吸道傳染的DNA 皰疹病毒，在淋巴細胞內可長期潛伏存在，該病毒除可引起傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis, IM）外，也可引起急、慢性肝炎[1]，這可能與EBV 感染后肝細胞水腫、氣球樣變性或點狀壞死、肝竇內以淋巴細胞、吞噬細胞浸潤等關系密切。有學者研究表明，EBV 病毒感染后所致肝損傷及程度與EBV 單獨感染、合并感染形式及免疫功能狀態有著密切關系[2]。本文就56 例EBV 感染及感染狀態所致相關性肝損傷患者進行回顧性分析，旨在了解單純EBV 感染及合并其他病毒感染相關性肝損傷及程度與T 淋巴細胞亞群表達水平變化的相關性，為早期護肝、抗病毒治療及免疫調節治療提供一定的理論參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2012年6月—2018年8月川北醫學院附屬醫院診斷為EBV 感染相關性肝損傷的56 例患者。其中，男性30 例，女性26 例；年齡10～60 歲，中位年齡35.7 歲。其中，單純EBV 感染相關性肝損傷的患者36 例（單純EBV 感染組）：男性20 例，女性16 例；年齡10～58 歲，中位年齡35.3 歲；合并其他病毒感染相關性肝損傷患者20 例（EBV 合并感染組）：男性12 例，女性8 例；年齡10～60 歲，中位年齡35.9 歲。診斷需符合下列2 條之一：①血清學抗體檢測提示急性EBV 感染或慢性感染急性發作伴有肝損傷并達到肝炎診斷標準；②分子生物學方法包括PCR、原位雜交和Southern 雜交從患者血清檢測EBV-DNA 陽性伴有肝損傷并達到肝炎診斷標準。同時選取同期20 例體檢者為健康對照組。其中，男性11 例，女性9 例；年齡11～60 歲，中位年齡34.8 歲，3 組性別構成比、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 診斷標準

EBV 感染診斷需具備下列條件：①有典型臨床表現和體征，如發熱、咽峽炎、淋巴結腫大、肝脾腫大、皮疹等；②循環血常規異型淋巴細胞＞10%；③EBV衣殼抗原IgM（抗EBV-IgM）陽性；④肝功能損傷是指谷丙轉氨酶升高4 倍以上，伴或不伴膽紅素明顯升高[3]，肝功能損傷由嗜肝或非嗜肝病毒感染所致，已排除藥物、細菌、真菌、自身免疫因素等所致肝損傷。

1.3 治療方法

所有EBV 相關性肝損傷患者入院后予臥床休息、調控體溫及預防感染等對癥治療，由于是發病早期（病程的前1 或2 天），均使用阿昔洛韋靜脈滴注治療，療程3～5 d。同時給與復方甘草酸苷針進行保肝治療至肝功能正常，所有患者均在持續治療第7天時采取靜脈血做肝損傷指標與T 淋巴細胞亞群計數檢測。患者在體溫正常，肝功能正常后出院。

1.4 檢測方法

1.4.1 標本采集 EBV 感染相關性肝損傷患者與健康對照組均于入院及體檢當天采取循環靜脈血分離血漿，并進行游離EBV-DNA 載量、肝功能、T 淋巴細胞亞群計數等檢測；EBV 感染相關肝損傷患者采取循環靜脈血進行甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、科薩奇B 組病毒及自免肝等檢測，治療7 d 后再進行游離EBVDNA 載量、肝功能、T 淋巴細胞亞群計數等檢測。

1.4.2 循環血T 細胞亞群檢測 取循環靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。在各試管中加入10 μl 由CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC 和CD3-FITC/ CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC 組成的四標記單克隆抗體，同時加注100 μl 抗凝循環靜脈血混勻并標記30 min，并加入固定劑30 μl 固定5～10 min，隨后加紅細胞溶解液1 ml 溶解紅細胞10～20 min，最后加磷酸鹽緩沖液后用流式細胞儀計數10 000個淋巴細胞并進行分檢。

1.4.3 循環血游離EBV-DNA 檢測 EBV 感染相關性肝損傷患者EBV-DNA 檢測采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR），試劑盒由中山大學達安基因公司提供，采用Icyclerq qRT-PCR 儀。

1.4.4 肝功能檢測 采用ADVIA 2400 全自動生化分析儀檢測肝功能，HBV 感染血清標志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）采用化學發光法檢測，嚴格按說明書操作，其他病毒感染標志物采用酶聯法檢測。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗或方差分析，其中方差分析兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用Pearson 進行相關性分析；P＜0.05 為差異有統計學 意義。

2 結果

2.1 EBV 感染分布及構成比

56 例EBV 病毒感染者中，單純EBV 感染組36 例 （64.29%），EBV 合并感染組20 例（35.71%），其中合并HAV 感染2 例（3.57%），合并HBV 感染8 例（14.29%），合并HCV 感染1 例（1.79%），合并CBV感染2 例（3.57%），合并VZV 感染3 例（5.36%），合并HBV、VZV 感染4 例（7.14%）。

2.2 各組肝功能情況

各組肝功能指標比較，經方差分析，差異有統計 學意義（P＜0.05）；單純EBV 感染組與EBV 合并感染組的肝功能指標均較健康對照組升高（P＜0.05），EBV 合并感染組肝損傷程度較單純EBV 感染組重（P＜ 0.05）。見表1。

2.3 單純EBV 感染組與EBV 合并感染組治療前后T 淋巴細胞亞群的變化情況

治療前各組T 淋巴細胞亞群水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；單純EBV 感染組、EBV 合并感染組的CD3+T、CD8+T 水平高于健康對照組，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平低于健康對照組（P＜ 0.05）；EBV 合并感染組CD3+T、CD8+T 高于單純EBV 感染組，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平低于單純EBV 感染組 （P＜0.05）；治療后單純EBV 感染組CD3+T、CD8+T 水平較治療前下降，CD4+T 水平較治療前上升（P＜0.05）；治療后EBV 合并感染組CD3+T、CD8+T 水平較治療前下降，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平較治療前上升（P＜ 0.05），治療后單純EBV 感染組與EBV 合并感染組比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），EBV 合并 感染組CD3+T、CD4+T、CD8+T 水平高于EBV 單純感染 組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組肝功能指標比較 （±s）

表1 各組肝功能指標比較 （±s）

注：①與健康對照組比較，P ＜0.05；②與單純EBV 感染組比較，P ＜0.05。

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表2 各組T 淋巴細胞亞群變化情況 （±s）

表2 各組T 淋巴細胞亞群變化情況 （±s）

注：①與健康對照組比較，P ＜0.05；②與治療前比較，P ＜0.05；③與同列單純EBV 感染組比較，P ＜0.05。

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2.4 單純EBV 感染組治療前后EBV-DNA 載量與T淋巴細胞亞群的相關性

單純EBV 感染組治療前后CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T 水平 與EBV-DNA載量無相關性（P＞0.05）。見表3。

2.5 EBV 合并感染組治療前后EBV-DNA 載量與T淋巴細胞亞群的相關性

EBV 合并感染組治療前后CD3+T，CD4+T，CD8+T，CD4+/CD8+T 水平與EBV-DNA 載量間無相關性（P＞0.05）。見表4。

表3 單純EBV 組治療前后EBV-DNA 載量與 T淋巴細胞亞群的相關性

表4 EBV 合并感染組治療前后EBV-DNA 載量與 T淋巴細胞亞群的相關性

3 討論

病毒、藥物、酒精等均可導致肝組織損傷，病毒感染是導致肝損傷最為常見的原因之一。除HBV、HCV 等嗜肝細胞病毒感染所致肝損傷外，目前的非嗜肝病毒如EBV 感染所致肝損傷的發生率也越來越高。EBV 是一種嗜淋巴細胞的DNA 病毒，屬于皰疹病毒γ 亞科[4]，其通過侵犯B 淋巴細胞來發揮致病作用，因其表面存在EBV 受體而致B 細胞抗原性改變，活化T 淋巴細胞后轉化為細胞毒性效應細胞（EBVCTL），從而直接破壞攜帶EBV 的靶細胞（主要為B淋巴細胞）。EBV感染可導致全身多系統，多器官損傷，其中肝臟是最常見的器官損害[5]。本組56 例EBV 合并感染中，合并HBV 感染最為多見，這與劉雅等研究報道一致[6]，該文獻指出，各種合并型病毒性肝炎患者中HBV 重疊EBV 感染最為常見，這是由于HBV 感染者的人群基數大，同時慢性乙性肝炎患者體內T 淋巴細胞免疫調控功能低下，病程中易重疊感染EBV[7]。本研究結果表明，EBV 合并感染組肝損傷程度較單純EBV 感染組重，這與蔡尚原等[8]報道相一致。可見EBV 合并其他病毒感染的患者肝功損害更重，且與單純EBV 感染患者相比，合并EBV 感染可加重肝臟損害，更易進展為肝纖維化、肝硬化、肝癌[6]。EBV 感染所致肝損害的病理機制尚不完全清楚，EBV 本身不具備損害肝細胞、血管內皮細胞的作用，且損害程度與EBV 含量并無相關性，而肝細胞損傷的病理機制是因肝小葉、門管區單核淋巴細胞浸潤（多為CD3+T、CD8+T 淋巴細胞），進而造成肝實質點狀壞死伴膽汁淤積[9]。本研究結果表明，治療前單純EBV 感染組，EBV 合并感染組的CD3+T、CD8+T 細胞亞群水平高于健康對照組，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平低于健康對照組，EBV 合并感染組CD3+T、CD8+T 高于EBV 單純感染組，CD3+T、CD4+/CD8+T 水平低于EBV 單純感染組，這與崔強華等[10]報道結果一致。作者認為，產生這一結果的原因可能是：CD3+是所有T 細胞的表面標志，CD4+是輔助性T 細胞（Th）的表面標志，具有輔助細胞免疫與體液免疫的作用，CD4+T 淋巴細胞的數量與頻率上調，可誘發免疫功能亢進，CD4+T 淋巴細胞數量與頻率的下調可表示免疫輔助功能降低，CD8+則是細胞毒性T 細胞（Tc）的表面標志，可直接殺傷靶細胞或誘導靶細胞凋亡，當CD8+T 淋巴細胞受到刺激后進行增殖，導致異性淋巴細胞比例增加[11]。EBV主要潛伏在B 淋巴細胞中，病毒增殖與高表達時細胞表面可表達多種抗原，并經抗原提呈細胞提呈后激CD8+T 淋巴細胞，引發細胞毒效應殺傷受到感染的B淋巴細胞，導致CD4+T 淋巴細胞大量消耗，外周血中CD4+T 細胞數量下降，患者出現CD4+/CD8+T 下降甚至倒置。CD4+及CD8+T 淋巴細胞比值反應機體的免疫狀況，其數量與頻率下調與免疫系統損傷的程度相關。本研究中合并感染組患者CD3+和CD8+T 淋巴細胞表達率高于單純感染組，合并感染組患者CD4+T 淋巴細胞的表達率和CD4+/CD8+比值均低于單純感染組，這提示合并感染組T 淋巴細胞亞群紊亂程度更高，與陳靜[12]等研究結果相似。根據本實驗的結果，作者推測，可能是合并感染組肝功能損害更為嚴重，患者T淋巴細胞激活程度更高，導致CD4+與CD8+T 淋巴細胞比例降低，產生大量促炎因子，使免疫損傷程度更重。本研究結果表明，治療后CD3+T、CD8+T 較治療前下調明顯，CD4+T、EBV 合并感染組的CD4+/CD8+T上調，CD3+T、CD4+T、CD8+T水平高于EBV單純感染組，作者分析認為，EBV 感染后的肝損傷常伴有Th1/Th2細胞比例失衡，表現為Th1 型細胞因子功能障礙，Th2型細胞因子功能加強，導致其免疫功能降低，促進病情進展。

本研究結果顯示，兩組治療前后，CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T 水平與EBV-DNA 載量無相關性，這與朱嬋虹等[13]報道結果不一致，朱嬋紅等認為：EBV-DNA 水平主要是反應體內病毒復制及感染情況，EBV-DNA 水平與是否合并其他病毒感染以及病情的嚴重程度正相關，臨床可以根據EBV-DNA 載量來判斷病情嚴重程度[13]。筆者認為，EBV 病毒性肝炎的發生主要是T 淋巴亞群數量及頻率紊亂導致免疫功能失衡，而CD3+、CD8+T 淋巴細胞浸潤及所釋放的致/抑炎因子失衡導致對肝細胞的免疫損傷，EBV 只是導致肝損傷中免疫反應發生的啟動因子，與EBV-DNA 載量無關。張慧等[5]對EBV 感染后肝功能正常組和異常組患者的研究發現，兩組患者外周血中EBV-DNA載量無差異，而肝功能異常組CD4+T 淋巴細胞、CD4+/CD8+T 下降更明顯，表明EB 病毒性肝炎的發生與病毒載量無直接相關性。

筆者分析認為，對EBV 病毒感染所致病毒性肝炎，其肝損程度可能與機體是否合并其他病毒感染和機體免疫狀況有關。EBV 肝炎也可能與EBV 病毒作為抗原能刺激機體產生特異性抗體，形成免疫復合物，激活免疫反應的強烈程度有關。本研究結果顯示，多病毒重疊感染所致肝損傷明顯，病情較重，病程長，這一點需引起重視[14]。本研究不足之處在于，由于是回顧性分析，未進行出院的隨訪與相關指標的跟蹤，特別是T 淋巴細胞及主要細胞因子水平與EBV-DNA載量間關系的跟蹤，有待進一步研究。加之，本研究樣本偏少，研究對象僅為一個醫療機構而非多中心研究，數據存在偏差的局限性。但仍期望通過本研究加深臨床醫師對EBV 病毒感染的重視，患者在出現肝損傷時，不僅僅是嗜肝病毒感染可以，也要重視非嗜肝病毒感染及其他原因所致。