高效液相色譜法測定復(fù)方黃葵顆粒中金絲桃苷、虎杖苷的含量

張清華，劉 燕

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

復(fù)方黃葵顆粒的源處方是山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院主任醫(yī)師張兆峰教授治療前列腺炎的經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱解毒，利濕清濁，活血通絡(luò)，散瘀止痛的功效，專為濕熱下注所致的慢性前列腺炎及前列腺增生癥所設(shè)[1]。本藥的開發(fā)有望提供一種安全有效、價(jià)格低廉、服用方便的中成藥制劑，以解除廣大前列腺炎患者的病苦。為控制本品質(zhì)量，保證臨床療效，對本品進(jìn)行了質(zhì)控研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀，Waters 600E泵，2996PDA檢測器，717plus自動進(jìn)樣器（美國Waters公司）；Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）不銹鋼柱；Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）不銹鋼柱。

1.2 試藥

金絲桃苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）；虎杖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純，天津科密歐）；磷酸（分析純，天津科密歐）；檸檬酸（分析純，天津科密歐）。

2 金絲桃苷含量測定研究[2-4]

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml中含金絲桃苷100 μg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品適量，研細(xì)，取約0.7 g，精密稱定，置入25 ml量瓶，加甲醇15 ml，超聲（功率100 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照液的制備 將處方中除去黃蜀葵花，按處方比例及制備工藝，制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）不銹鋼柱；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；檢測波長：360 nm；流動相：乙腈-0.5 %檸檬酸（14:86）。對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液的高效液相色譜（HPLC）圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系的考察

取金絲桃苷對照品5 mg，精密稱定，置入10 ml量瓶，加甲醇適量，超聲處理使溶解，加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，分別精密量取0.20，0.40，0.80，1.0，2.0 ml，置入5 ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液；分別精密吸取上述對照品貯備液及對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。以對照品溶液濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=22 869C-32 081，相關(guān)系數(shù)r=0.999 99。由回歸方程和標(biāo)準(zhǔn)曲線可見，金絲桃苷對照品濃度在20.76～519.0 μg/ml范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 對照品溶液（A）、供試品溶液（B）及陰性對照液（C）的色譜圖

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取同一對照品溶液和供試品溶液各10 μl，分別于0，1，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣。對照品溶液和供試品溶液峰面積RSD分別為0.14 %，0.32 %，表明二者在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，其峰面積RSD為0.10 %，表明本方法具有較好的精密度。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號為20170618的樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，依法測定含量，平均值為15.92 mg/袋，RSD為0.57 %。結(jié)果表明，本方法具有較好的重復(fù)性。

2.7 回收率試驗(yàn)

取本品細(xì)粉（批號：20170618，含量為15.92 mg/袋）9份，分為3組，每組3份，每組取樣量分別為0.21，0.26，0.31 g，精密稱定，分別精密加入金絲桃苷對照品溶液（0.7010 mg/ml）1.0，0.8，1.2 ml，按2.1.2項(xiàng)下方法制備9份供試品溶液，依法測定含量，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，本方法具有較好的回收率。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測定

按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定3批樣品，3批樣品（批號：20170618，20170619，20170620）金絲桃苷平均含量分別為15.59，16.01，14.30 mg/袋。

3 虎杖苷含量測定研究[5-6]

3.1 溶液的制備

3.1.1 對照品溶液的制備 取虎杖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每ml中含虎杖苷40 μg的溶液，即得。

3.1.2 供試品溶液的制備 取樣品適量，研細(xì)，取細(xì)粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.1.3 陰性對照液的制備 將處方中除去虎杖，按處方比例及制備工藝，制成陰性樣品，按3.1.2項(xiàng)下方法制成陰性對照液。

3.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）不銹鋼柱；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；檢測波長：306 nm；流動相：乙腈-0.05 %磷酸（11:89）。對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液的色譜圖見圖2。

圖2 對照品溶液（A）、供試品溶液（B）及陰性對照液（C）色譜圖

3.3 線性關(guān)系的考察

取虎杖苷對照品10 mg，精密稱定，置入25 ml量瓶，加稀乙醇適量，超聲處理使溶解，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，從中分別精密量取0.20，0.50，1.0，2.0，2.5，5.0 ml，置入10 ml量瓶，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液；分別精密吸取上述對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。以對照品溶液濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=45 495C-51 856，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。通過回歸方程和標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，虎杖苷對照品濃度在7.776～194.4 μg/ml范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取同一對照品溶液和供試品溶液各10 μl，分別于0，1，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，其峰面積分別為0.37 %，0.31 %。結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，其峰面積值RSD為0.30 %。結(jié)果表明，本方法具有較好的精密度。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號為20170618的重量差異項(xiàng)下的本品，按3.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法測定含量，平均值為2.78 mg/袋，RSD為0.64 %。結(jié)果表明，本方法具有較好的重復(fù)性。

3.7 回收率試驗(yàn)

取批號為20170618的本品細(xì)粉（含量為2.78 mg/袋）9份，分為3組，每組3份，每組取樣量分別為0.58，0.72，0.86 g，精密稱定，分別精密加入虎杖苷對照品溶液（0.3850 mg/ml）0.64，0.8，096 ml，按3.1.2項(xiàng)下方法制備9份供試品溶液，依次測定，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，本方法具有較好的回收率。

3.8 樣品測定

按3.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定3批樣品（批號：20170618，20170619，20170620），虎杖苷含量分別為15.59，16.01，14.30 mg/袋。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

4.1 2015年版中國藥典收載了本品的君藥黃蜀葵花，并在含量測定項(xiàng)下采用高效液相色譜法（HPLC）測定金絲桃苷的含量，因此本品增加了金絲桃苷的含量測定。結(jié)果表明，超聲提后取續(xù)濾液直接進(jìn)樣，方法簡便，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，且陰性對照液無干擾，可作為本制劑的質(zhì)控方法。

4.2 采用超聲提取，取續(xù)濾液直接進(jìn)樣，經(jīng)HPLC測定本品中虎杖苷含量，方法簡便，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，且陰性對照無干擾，可作為本制劑的質(zhì)控方法。