α-亞麻酸乙酯（75%）急性毒性和遺傳毒性研究

吳超權，周 智，韋奇志，方珍文，陳長艷，楊橋櫻，秦秀娟

（廣西食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

α-亞麻酸是人體必需的不飽和脂肪酸，需從日常飲食中獲取，α-亞麻酸在體內可轉變為具有顯著生理活性的EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸），具有降血脂、降膽固醇、抗血栓形成等作用[1]。歐美和日本等國家已經立法，將α-亞麻酸作為藥物或食品添加劑，用來預防心血管疾病、癌癥、老年癡呆、視力低下等病癥。α-亞麻酸乙酯與α-亞麻酸有同樣的生理功能，且α-亞麻酸乙酯的化學穩定性更好，應用于保健食品的開發前景廣闊。但其毒理學和安全性評價方面的研究不足，國內鮮有報道。因此，本文對α-亞麻酸乙酯進行急性毒性和遺傳毒性研究，為α-亞麻酸乙酯作為保健食品原料進一步開發利用提供可靠的毒理學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HH-S恒溫水浴（江蘇金壇醫療儀器廠）；BD240生化培養箱（德國賓德公司）；CHA-S氣浴恒溫振蕩器（常州國華）；KS130C振蕩器（艾卡儀器設備公司）；TD5A-WS臺式低速離心機（湖南湘儀）；50I熒光顯微鏡（尼康）；BX63全自動智能型數字顯微鏡（奧林巴斯）；CX31顯微鏡（奧林巴斯）。

1.2 試藥

α-亞麻酸乙酯（75 %）（河北欣奇典，批號：20150407），置陰涼干燥處儲藏，每次開封后充入氮氣密封保存；玉米胚芽油[嘉里糧油（防城港），批號：20150105]；營養肉湯培養基（廣東環凱，批號：0570201）；頂層瓊脂培養基（Solarbio，批號：20150119）；Vogel-Bonner（V-B）培養基E（自配）；L-組氨酸（國藥集團，批號：20150213）；D-生物素（國藥集團，批號：20150223）；葡萄糖（天津大茂，批號：20150201）；Aroclor 1254誘導雄性SD大鼠肝臟微粒體酶S9及輔助因子（凍干型S9混合液，Moltox公司，批號：3726）；胎牛血清[Gibco by Life Technological Corporation (USA)]；吉姆薩染液（北京索萊寶公司）；環磷酰胺（Roche）；甲醇（國藥集團）；1 %伊紅染液（Roche）；純化水（自制）。

1.3 菌株

鼠傷寒沙門菌回復突變試驗用菌株TA97a，TA98，TA100，TA102（Moltox公司，中國代理商：上海寶錄），-80 ℃儲藏。

1.4 實驗動物

KM小鼠，SPF級，雌雄兼用，由廣西食品藥品檢驗所實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK桂2014-0001，動物飼養于本所屏障環境動物實驗室（使用許可證號SYXK 桂2014-0002）；溫度20～25 ℃，相對濕度58 %～70 %；飼喂小鼠生長繁殖飼料（北京科奧協力飼料有限公司，生產許可證號SCXK京2014-0010）及滅菌生活用水。

2 方法[2]

2.1 急性毒性試驗

KM小鼠20只，雌雄各半，體重18.1～20.8 g，按性別分籠群養；禁食不禁水16 h后，按20 ml/kg以樣品直接灌胃1次。觀察灌胃后14 d內小鼠的全身反應及死亡情況，存活的動物按性別計算增重值及增重率。

2.2 Ames試驗

取經鑒定符合要求的鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97a，TA98，TA100，TA102。試驗時以溶媒將樣品α-亞麻酸乙酯（75 %）分別配制成50，10，2，0.4，0.08 mg/ml的供試液，供試液無懸浮和沉淀物。試驗菌株37 ℃增菌培養10 h，將頂層瓊脂培養基2.0 ml分裝于試管，每管依次加入試驗菌液0.1 ml、樣品溶液0.1 ml、S9混合液0.5 ml（需代謝活化時），混勻后迅速傾入底層瓊脂平板，使形成5000，1000，200，40，8 μg/皿的供試物劑量，倒置于培養箱中37 ℃孵育48 h。每試樣檢查皿加或不加S9混合液均做3個平行皿，記錄每組回變菌落數，重復1次。同時設溶媒對照、自發對照、陽性誘變劑對照組。數據統計：記錄每皿回變菌落數，并求平均值和標準差。結果判定：受試物組回變菌落數增加一倍以上，并有劑量-反應關系，或某一測試點有可重復的陽性結果，即可認為受試物誘變試驗陽性。陽性誘變劑使用種類和劑量見表1。

表1 陽性誘變劑對照物及劑量

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

以玉米胚芽油將樣品α-亞麻酸乙酯（75 %）分別配制成0.5，0.25，0.125 g/ml，取KM小鼠60只，雌雄各半，體重26～29 g，分籠群養，按體重、性別隨機分成6組，分別為α-亞麻酸乙酯10，5，2.5 g/kg 3個劑量組、環磷酰胺40 mg/kg陽性對照組、玉米胚芽油溶媒對照組和純化水陰性對照組。各組動物分別給予受試物2次，間隔24 h，灌胃量均為20 ml/kg，灌胃前16 h動物禁食不禁水。第2次給藥后6 h，頸椎脫臼處死小鼠，隨即剖取股骨，用胎牛血清沖洗骨髓腔收集骨髓細胞，沖洗液經離心制成濃度適中的細胞懸液，涂片，甲醇固定7 min，吉姆薩染液染色15 min，超純水沖洗、晾干；鏡下觀察嗜多染紅細胞和成熟紅細胞，每只動物計數1000個嗜多染紅細胞，觀察含有微核的嗜多染紅細胞數，微核率用千分率表示；每只動物計數200個嗜多染紅細胞，同時記錄成熟紅細胞，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞（PCE/NCE）比值。采用雙側t檢驗分析處理數據，結果判定：樣品組與溶媒對照組相比，微核率有明顯劑量反應關系且差異具有統計學意義時，可確認為陽性結果。若統計學差異有統計學意義，但無劑量反應關系時，則須進行重復試驗，結果能重復者可確定為陽性。

2.4 小鼠精子畸形試驗

以溶媒將樣品α-亞麻酸乙酯（75 %）分別配制成0.5，0.25，0.125 g/ml，取雄性小鼠30只，體重27.4～33.1 g，分籠群養，隨機均分為6組，每組5只，分別為α-亞麻酸乙酯10，5，2.5 g/kg 3個劑量組、環磷酰胺40 mg/kg陽性對照組、玉米胚芽油溶媒對照組和純化水陰性對照組。采用灌胃方式每天給予受試物1次，20 ml/kg，連續5 d。于首次給予受試物后的第35天，頸椎脫臼處死小鼠，隨即剖取兩側附睪，放入有適量生理鹽水（約2 ml）的平皿中。用眼科剪將附睪縱向剪1～2刀，靜止3～5 min，輕輕搖動，用4層擦鏡紙過濾，吸濾液涂片。空氣中干燥后，用甲醇固定15 min，充分干燥，置1 %伊紅染液中染色1 h，用水輕輕沖洗，晾干。在低倍鏡下尋找背景清晰、精子重疊較少的部位閱片，用高倍鏡順序檢查精子形態。每只動物計數結構完整的精子1000個，觀察精子的畸形情況，畸形類型可分為無鉤、香蕉形、胖頭、無定型、尾折疊、雙頭、雙尾等。采用Wilcoson秩和檢驗分析處理數據。結果判定：樣品組與溶媒對照組比較，精子畸形率為溶媒對照組的倍量或差異有統計學意義，并有劑量反應關系，判定為精子畸形陽性。

3 結果

3.1 急性毒性試驗

灌胃后至14 d內小鼠的外觀、活動、進食、排泄等均未見明顯異常；無死亡現象；小鼠體重增長情況正常，見表2。結果表明，小鼠一次性灌胃給予α-亞麻酸乙酯（75 %），未見明顯的急性毒性反應，最大耐受量大于20 ml/kg BW（17.62 g/kg BW）。按急性經口毒性分級標準，樣品屬于無毒級（LD50＞15 000 mg/kg為無毒級）。

表2 α-亞麻酸乙酯（75 %）小鼠經口急性毒性試驗體重增長情況

3.2 Ames試驗

結果見表3。樣品劑量為5000，1000，200，40，8 μg/皿對上述4個試驗菌株加S9或不加S9，回變菌落數與溶媒對照相近，差異無統計學意義（P＞0.05），亦無劑量-反應關系，未超出自發回變數的2倍，表明樣品在加S9或不加S9的條件下，對4個菌株的誘變結果呈陰性。提示樣品對鼠傷寒沙門菌無明顯致突變性。

3.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

結果見表4、表5。與溶媒對照組比較，α-亞麻酸乙酯3個劑量組微核率基本一致（P＞0.05）；各劑量組的骨髓PCE/NCE比值均在正常范圍，均不低于溶媒對照組的20 %，α-亞麻酸乙酯3個劑量組骨髓PCE/NCE比值與溶媒對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；表明樣品的小鼠骨髓細胞微核試驗結果為陰性，樣品對小鼠骨髓PCE/NCE比值無明顯影響。按性別分別統計分析，結果相同。

表3 α-亞麻酸乙酯（75 %）Ames試驗的菌株回變結果（n=6）

表4 α-亞麻酸乙酯（75 %）對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響

表5 α-亞麻酸乙酯（75 %）對小鼠骨髓PCE/NCE比值的影響

表6 α-亞麻酸乙酯（75 %）小鼠精子畸形試驗結果

3.4 小鼠精子畸形試驗

結果見表6。由表6可見，α-亞麻酸乙酯3個劑量組的小鼠精子畸形率與溶媒對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明樣品的小鼠精子畸形試驗結果為陰性，提示樣品對小鼠精子無明顯致畸作用。具體精子畸形類型數量及比值見表7。

4 討論

近年α-亞麻酸乙酯逐漸引起國際社會的關注，因其具有降血脂、保肝護肝、預防心血管疾病、抗血栓形成、預防老年癡呆、預防肝病、促進小兒大腦發育等功能，具有廣闊的開發前景[3-7]。但其安全性評價鮮有報道。

本研究結果提示：α-亞麻酸乙酯（75 %）的急性毒性最大耐受量大于17.62 g/kg BW；各劑量組對4種組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌株在存在或不存在S9代謝活化系統兩種條件下，回變菌落數與溶媒對照組相近，差異無統計學意義，亦無劑量-反應關系，未超出自發回變數的2倍，表明樣品在加S9或不加S9的條件下，對4個菌株的誘變結果呈陰性；α-亞麻酸乙酯（75 %）各劑量組的微核率與溶媒對照組比較，差異無統計學意義，表明其小鼠骨髓細胞微核試驗結果為陰性；α-亞麻酸乙酯（75 %）各劑量組的精子畸形率與溶媒對照組比較，差異均無統計學意義，表明其小鼠精子畸形試驗結果為陰性。本研究表明α-亞麻酸乙酯（75 %）屬于無毒級，鼠傷寒沙門菌回復突變、骨髓細胞微核、小鼠精子畸變試驗3項試驗結果均為陰性，未見遺傳毒性作用。

表7 α-亞麻酸乙酯（75 %）小鼠精子畸形試驗畸形類型及比值