貴州油茶葉斑病Lasiodiplodia theobromae病原鑒定研究

秦紹釗 鄧潔 王建偉

摘 要：對貴州油茶主要種植區采集到的油茶葉斑病葉片，采用形態學鑒定及多基因分子鑒定的方法，對分離的葉枯病病原菌進行系統鑒定。結果表明：在編碼轉錄延伸因子（TEF）、微管蛋白基因（TUB2）2基因所構建的系統發育樹中，KLXYL-3-2菌分別與葡萄座腔菌屬KP642037.1、KX464911.1和MG000590.1菌株聚為一個獨立的進化分支且置信度為99%，結合其形態特征，將其鑒定為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。

關鍵詞：油茶;可可毛色二孢菌;葉枯病;形態學;分子鑒定

文章編號：1004-7026（2020）01-0090-02? ? ? ? ?中國圖書分類號：S435.711? ? ? ? 文獻標志碼：A

油茶是貴州省農業產業革命的特色產業之一，截至2019年9月，貴州油茶現有26個品牌。隨著油茶基地規模逐漸擴大、低產林改造和油茶精深加工水平提升，油茶產業的重要性日漸凸顯，病害防控工作的重要性得以體現。油茶葉斑病發病癥狀包括枝枯、根腐、枯萎、葉斑及叢枝等。劉小玉等（2019）[1]報道海南油茶葉斑病的病原為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。任亞峰等（2019）[2]報道在貴州茶樹葉斑病的病原為可可毛色二孢（L.theobromae）。目前，貴州未見由可可毛色二孢菌引起的油茶葉斑病的相關報道。

可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）屬葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）病原菌的無性型[3]。葡萄座腔菌的一些種是弱勢致病菌，它們一般不會直接侵染寄主植物，但作為葉枯病致病菌的可可毛色二孢菌廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區，寄主十分廣泛。本試驗通過病葉組織分離法對病原菌進行分離、培養，并對其開展形態學及分子生物學研究，旨在明確病原菌種類，為探明其發生傳播規律及防治奠定研究基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

2015—2018年采集油茶葉斑病葉片標本于黔東南州凱里市、錦屏縣及黃平縣，以及銅仁市石阡縣、江口縣及思南縣，分別集中于6—7月、10—11月采集病樣，典型病征（圖1）。發病初期葉緣變色，向內葉蔓延;發病后期病斑淡褐色，病部和健康部分界線明顯，病斑凹陷，逐漸擴大成不規則病斑。

1.2? 方法

1.2.1? 病原菌的分離純化

常規組織分離法：先用75%的酒精處理病健交界的組織，0.1%升汞溶液消毒，無菌水漂洗干凈，PDA培養基純化培養，置于4 ℃下保存備用。

1.2.2? 病原菌的形態鑒定

取5 mm菌餅，在PDA平板28 ℃光照16 h培養，2～5 d連續觀察菌落的形態、顏色。取10 μL分生孢子懸浮液，在光學顯微鏡下觀察記錄其大小及形態特征。

1.2.3? 分子鑒定與系統發育分析

取20 mg菌絲經液氮研磨，樣品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒，Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒SK8259。擴增引物如下：Bt2a5GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3，Bt2b5ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3;EF1F5GTCGTYGTYATYGGHCAYGT3，EF1R5ACHGTRCCRATACCACCRATCTT3。

將測序rDNA-TEF和rDNA-TUB2序列與GenBank中相關序列分別用ClustalX1.83軟件進行比對分析。選出與各分離菌株相似度較高的相應序列，采用MEGA7.0.14軟件中的最大簡約法（MP）做聚類分析，把所有堿基狀態處理為無序，并給以相同權重。自舉檢驗重復1 000次以獲得各分支的支持率，構建系統發育樹。

2? 結果與分析

2.1? 病原菌菌落與形態特征

采用常規組織塊法分離得到菌株編號為KLXYL-3-2。菌株KLXYL-3-2在PDA培養基平板形成圓形或近圓形菌落。菌落正面呈棉絮狀，初生菌絲灰白色，邊緣蓬松，氣生菌絲生長旺盛，菌落后期轉墨綠色或淺黑色，36～48 h菌絲即可布滿整個PDA平板（圖2A）。菌落反面可見灰黑色，甚至黑色（圖2B）。子座呈圓球狀或棍棒狀，大小為（1.8～9.2）？滋m×（1.9～3.8） mm。子座內有多個分生抱子器。

分生孢子為單孢，呈卵圓形或橢圓形，大小約為（12.5～16.2） ？滋m×（19.5～28.8） ？滋m，早期無色似透明（圖3）。

這些形態特征與劉小玉等人描述可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）形態特征基本一致。因此，初步確認菌株KLXYL-3-2為可可毛色二孢菌。

2.2? 分子鑒定

以葉斑病病原菌6個菌株的DNA為模板，對編碼轉錄延伸因子（TEF）、微管蛋白基因（TUB2）進行擴增并測序。分別與GenBank中同屬菌株序列進行同源性比較，確定6個菌株同屬于可可毛色二孢菌（L.theobromae），與形態學鑒定結果一致。

代表菌株KLXYL-3-2的TEF和TUB2基因與其他同屬菌株的序列經最大簡約法（MP）共同構建的系統發育樹中，分別與可可毛色二孢菌（L.theobromae）菌株（KP642037.1、KX464911.1和MG000590.1）同源性高達99%～100%，進化分析聚在同一分支上，能與同屬其他菌株明顯區分開。因此，根據分離病原物的形態學特征，結合單基因（TEF-TUB2）系統發育學鑒定結果，將KLXYL-3-2鑒定為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。

3? 結論與討論

本研究所鑒定的油茶可可毛色二孢菌（L.theobromae），在貴州油茶葉枯病的相關研究屬于首次報道。田間調查期間發現，可可毛色二孢菌在油茶樹葉片、嫩莖上發病迅速，病斑擴展速度快，染病后期葉片枯萎、脫落，今后可能會上升為貴州油茶產區的主要病害。

參考文獻：

[1]劉小玉，余鳳玉，付登強，等.油茶葉斑病菌的分離、鑒定及生物學特性研究[J].中國熱帶農業，2019（86）：38-42.

[2]任亞峰，包興濤，李冬雪，等.茶樹葉斑病病原菌可可毛色二孢菌的鑒定[J/OL].http：//kns.cnki.net/KCMS/detail/11.2184.Q.20190304.1052.001.html.

[3]Punithalingam E.Plant diseases attributed to Botryodiplodia theobromae Pat [J]. Bibliotheca Mycologia，1980（71）：1-123.