中藥藥效活性成分遴選技術研究進展*

付人杰，戚 進，余伯陽

(中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198)

中醫藥學是兩千多年臨床實踐經驗的總結，其理論體系完整，具有深厚的歷史積淀與深刻的臨床價值。但由于中醫藥學的理論體系蘊含著我國古代樸素的哲學觀，其含義古樸深奧，很難為現代醫學體系所理解[1]。如何實現中醫藥的國際化是目前中藥現代化進程中的重要課題。為使中藥及其制劑為國際醫藥市場所接受，使中醫藥學具有現代科學理論支撐，基于中藥藥效活性成分的中藥現代化研究已成為一項長期戰略部署[2]。我國國土幅員遼闊，蘊藏著豐富的天然藥物資源，天然藥物成分具有骨架多樣，活性廣泛，高效低毒等特點，因此從中尋找和開發新藥已經成為現代新藥研發的主導策略[3]。然而中藥和天然藥物具有復雜次生代謝產物，并且藥效物質基礎模糊，這增加了從中發現和尋找新藥的難度[4]。近年來一些從復雜體系中發現和尋找活性成分的快速遴選方法已經迅速發展起來，本文對此進行綜述，以期為天然來源藥物活性成分遴選提供理論支撐和科學數據。

1 基于系統生物學的遴選技術

系統生物學是借助于實驗、計算方法與系統論相整合，來研究生物系統的組成以及相互之間動態變化關系的學科[5]。其整體化思想，與中醫藥的“整體觀”、“辯證觀”、“動態觀”完美契合。

1.1 代謝組學

代謝組學是探究生物體系受到外界刺激后其內源代謝物種類、數量及其變化規律的科學，可以從整體水平反映疾病治療過程中的小分子代謝物的動態變化[6]。常采用1H-NMR，13C-NMR，HPLC-MS等技術，對實驗動物的尿液、血清、血漿、組織、細胞及細胞內成分等樣本進行綜合檢測[7]。目前代謝組學發展到更為精準的分析，對于細胞器代謝物的分析研究越發多樣化，由于反向液相色譜不利于極性及離子性代謝成分的檢測，陰離子交換色譜以及多色譜-質譜聯用方法相繼被開發用于復雜代謝產物的分析鑒定[8]。將靶向和非靶向技術的優點相結合，憑借新方法良好的分辨率和特異性，舒一崧等基于非靶向代謝組學技術，借助UHPLC-QE Orbitrap HRMS利用譜圖匹配、碎片掃描、同為素識別等方法將目標聚焦到柑橘類中藥枳實及細胞色素P450，進一步探究其對化學誘導肝損傷的保護作用[9]。

1.2 蛋白質組學

化學蛋白質組學已成為藥物發現過程中表型遴選必不可少的手段[10]。Dai等[11]結合SILAC定量蛋白質組學，對黃芩苷(baicalin)給藥后HeLa細胞內蛋白質的BP結合含量進行分析，聯合生物信息對比分析后，聚焦到對baicalin不敏感的siCPT1A，隨后進行體外酶學實驗驗證，黃芩苷通過激活CPT1A，加速脂肪酸降解。蛋白質組學優越性在于能夠進行多靶點、高通量遴選，但在測定多種有機成分時不準確，會產生假陽性結果，核酸大分子也會對結果產生干擾，蛋白酶消化后，基于肽的蛋白質組學可能會錯過全長天然蛋白質中存在的關鍵信息。

1.3 基因組及轉錄組學

基因組學及轉錄組學研究依托的基因芯片技術，其原理是將特定的寡聚核苷酸序列或cDNA片段固定于基片上，基于mRNA可能與特定基因的固定化靶序列的高密度陣列雜交，定性或定量檢測雜交信號以獲取相關的生物學信息[12]。基因芯片可以實現微量化、高內涵、高通量的遴選研究，為藥物作用發現新的靶標，也為新藥遴選及研發提供新策略。其優勢在于在單次實驗過程中，可以對基因進行高通量分析，具有快速、高特異性的優越性[13]。周威等人依據人頸動脈正常組織及粥樣硬化和的基因表達數據，遴選出差異基因，發現復方丹參滴丸中有10個成分與藥物分子結構相似[14]。但基因芯片技術由于配套設施昂貴，獲得的結果存在假陽性、操作復雜、重復性差、分析泛圍狹窄，限制了其應用。

2 基于靶標的遴選技術

藥靶是指在疾病的病理過程中發揮某種作用的生物大分子，某種疾病的靶標被確認后，便可基于此來進行藥物遴選。早期藥物研發多以病原微生物為靶標，進而發現了抗生素，隨著研究水平不斷深入，分子生物學技術蓬勃發展，大量與疾病相關的受體和酶被發現，使藥靶的發現上升到分子水平[15]。因此基于受體-配體之間的親和作用，基于靶分子與配體結合的原理，從復雜體系中分離潛在配體的垂釣技術得到不斷革新[16]。目前該領域的技術如生物色譜，毛細管電泳，親和超濾，平衡透析，微透析和磁性納米垂釣等均廣泛應用于中藥活性成分遴選[17]。

2.1 親和超濾法

親和超濾是基于受體與配體特異性地結合的特性，將具有潛在配體的復雜體系與靶標大分子混合后，利用超濾膜對不同大小物質選擇透過性，截留有親和作用的配體，將截留下來的復合物通過使靶標大分子變性的方法，釋放出結合的配體[18]。親和超濾法應用范廣，設備低廉，操作簡單，具有新穎性、高特異性和普適性，方法不足之處在于由小分子與超濾膜的非特異性結合產生假陽性結果[19]。本課題組將親和超濾質譜法與在線清除自由基檢測技術相結合，同時對梔子中的MPO抑制劑和次氯酸清除劑進行遴選研究得到藏紅花酸衍生物作為梔子中MPO抑制劑，發現清除次氯酸的有效成分為喹啉酸衍生物及環烯醚萜苷類成分[20]。

2.2 平衡透析法

將靶標與配體溶液利用透析膜分隔開，建立濃度梯度，小分子以擴散壓為動力，穿過透析膜與靶標大分子結合，平衡透析法無法直接準確檢測與靶標結合的小分子，但通過檢測未結合的小分子含量，可測定結合的配體數量[21]。該方法操作簡便、裝置價格低廉、結果直觀。高迪等[22]采用平衡透析法，利用脂質體生物膜遴選中成藥脊痛寧片中的活性成分，發現了9個活性成分。但此方法不足之處在于獲取結果單一，低通量，需要色譜、光譜技術和熱力學分析等方法進行輔助解析。

2.3 毛細管電泳法(CE)

目前毛細管電泳法已成為一種通用、有效的微量分離技術[23]。該法操作簡單，樣品消耗少，分析時間短。Li等[24]報道了用CE結合HPLC-MS/MS遴選天然產物中表皮生長因子受體抑制劑的方法，對39種天然產物進行了研究。但毛細管電泳法檢測小分子時不穩定，重現性差。

2.4 生物反應器

生物反應器是模擬酶或其它微生物的功能，在體外進行生化反應的裝置[25]。Zhao等[26]利用三維細胞生物反應器結合高效液相色譜-光譜法培養3D細胞生物反應器遴選朱砂七提取物中的生物活性成分。但生物反應器的不足之處在于其制作費時費力，尚無標準化，商品化。

2.5 生物色譜技術

生物色譜技術是將生物活性材料如受體、酶、細胞膜或細胞等與色譜載體固著后作為固定相，利用活性成分與靶標特異性結合的原理，結合色譜技術的分離特點發展而成的新型活性成分遴選技術[27]。生物色譜法已成功應用于中藥活性成分的發現研究中[28]。Chen等[29]比較了用脂質體膜、紅細胞膜和心肌細胞膜與丹參化合物相互作用前后色譜圖，鑒定出12種可滲透的丹參化合物并證明其具有生物活性。生物色譜技術可以從復雜基質中進行活性成分的遴選，分離和闡明活性成分的結構[30]。該法不足之處在于色譜柱制備成本高、壽命短、傳質限制、活性降低、無法模擬人體環境因此而導致活性成分的漏遴[27]。

2.6 磁性配體垂釣

在配體垂釣的研究領域，配體垂釣效果隨著垂釣材料的發展不斷進步革新。目前研究最集中、應用最廣泛的配體垂釣材料就是磁性材料。依據磁性顆粒的大小可分為磁性納米粒子和普通磁性材料。磁性納米粒子在磁性材料中有著的獨特的優勢：超順磁性，這得益于磁性納米顆粒納米級別的粒徑，因此便于表面修飾來鍵合用于垂釣的靶標大分子，一般通過共價鍵來鍵合諸如酶、受體、抗原等靶標大分子[31]。Sileshi G Wubshet等[32]提出了一種生物分析平臺，結合磁性配體捕獲α-葡萄糖苷酶抑制譜和HPLC-HRMS-SPE-NMR，用于直接從粗植物提取物中鑒定α-葡萄糖苷酶抑制配體，成功鑒定了楊梅素3-O-α-L-鼠李糖苷，楊梅素，槲皮素和山奈酚作為α-葡糖苷酶抑制配體。然而除了酶這類生物大分子之外，有研究者利用磁性納米粒子上固定細胞膜的方法來進行配體垂釣。Tang等[33]首次將細胞膜包被的磁珠用于配體垂釣，利用紅細胞膜包被的磁珠從天然產物檢測潛在的活性成分，例如歐前胡素。

2.7 分子對接

鎖鑰模型和誘導契合學說是分子對接的基本原理，前者基于受體配體均為剛性結構的基礎，后者基于受體配體均為柔性結構，對接結果更加準確[34]。分子對接的方法分為剛體對接、半柔體對接及柔體對接，藥物發現過程中利用該方法完成姿勢預測，虛擬遴選和結合親和力估計的目的[35]。

目前，分子對接已廣泛應用于中藥活性成分的遴選中。中藥化學數據庫(TCMD)和中國天然產物數據庫(CNPD)已被成功開發并應用于先導化合物的設計，成為虛擬遴選的可靠武器[36]。Gao等[37]基于多受體-配體復合物的實驗結合結構建立了基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)抑制劑的藥效團模型，結合藥效團模型與分子對接進行虛擬遴選，從天然產物數據庫中發現四種新型MMP-9抑制劑。該技術目前也被應用于復方的活性成分虛擬遴選中。徐青青等[38]構建了六味地黃方中己知的21種主要化學成分及代謝產物結構配體分子庫，采用虛擬遴選技術分析了六味地黃方中抑制α-葡萄糖苷酶的有效物質。發現2種四環三萜類化合物結合能較低，成功推測了六味地黃方治療2型糖尿病的活性成分。當前對高度靈活配體的對接預測不太可靠，仍有一些理論和計算方面的挑戰需要克服。

3 基于成分本身的遴選技術

3.1 網絡藥理學

傳統的藥物發現模式是設計精選作用于個體藥物靶標的最合適配體。然而與多靶點藥物相比，精選的化合物可能表現出低于預期的臨床效果。整合網絡生物學和多向藥理學有望擴大目前中藥活性成分的空間[39]。Tang等[40]研究了用于治療過敏性鼻炎的復方：麻黃附子細辛湯，利用網絡藥理學方法，發現了四種預測成分具有抗炎作用。網絡藥理學的研究過程中，優化多種活動的同時平衡類似藥物的特性并控制不脫靶是一項艱巨的任務[39]。

3.2 血清藥物化學

基于入血成分可能是中藥有效成分這一假說，血清藥物化學研究采用中藥口服給藥后采集血清樣品，從血清中分離、鑒定移行成分的方法[41]。陳思通過血清藥物化學、文本挖掘和相似性匹配相結合的方法鑒別出四逆湯抗心衰的48個潛在活性成分[42]。中藥血清藥物化學理論體系簡單、技術成熟、設備普及、成本低廉。不足之處在適用于口服中藥，有效成分需經過血液循環，靈敏度低，需要化學分離、活性測定等過程，周期長，通量性較差[43]。

4 結 語

基于新型技術手段建立快速、有效的遴選方法是從“天然組合化合庫”中辨認、遴選藥效活性成分及開發新藥的前提。近年來，隨著多學科交叉應用與融合，基于生物親和作用的快速遴選模式不斷涌現，多種技術的聯合應用使中藥藥效活性成分的研究更高效率、高靈敏度、強特異性，進而在一定程度上為新藥開發提供助力。