寨卡病毒檢測技術的研究進展*

鄭 茂 綜述，劉 曉，袁成良 審校

(四川省德陽市人民醫院檢驗科，四川德陽 618000)

寨卡病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA包膜病毒，直徑為40～70 nm，核酸長度約10.7 kb，分別編碼3種結構蛋白(C、prM/M、E)和7種非結構蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)[1]。寨卡病毒進入人體后，多以隱性感染為主，引起低熱、皮疹、結膜炎及關節肌肉痛等非特異性臨床癥狀，易與登革熱病毒、基孔肯雅熱病毒感染等相混淆，早期診斷十分困難。寨卡病毒能通過胎盤和血腦屏障，孕婦感染后可能導致胎兒嚴重先天性缺陷，其中以新生兒小頭畸形最為常見。宮內感染寨卡病毒可能會使胎兒神經發育遲緩，膀胱及腎臟發育不全，成人感染寨卡病毒可能會引起吉蘭-巴雷綜合征(GBS)。因此，建立靈敏且特異的寨卡病毒早期檢測技術，對快速診斷病毒感染尤為必要，本文簡要闡述了寨卡病毒的流行病學特征，并重點對近年來寨卡病毒的檢測技術進行綜述。

1 寨卡病毒感染的流行病學特征

寨卡病毒感染的患者或其他靈長類動物均可作為病毒傳染源，通過蚊媒傳播、母嬰傳播、性傳播等方式擴散[2]。寨卡病毒最早于1947年在東非烏干達寨卡森林的恒河猴體內分離成功，并因此而得名，不久后在非洲、太平洋島國等地區陸續出現人感染寨卡病毒的報道；2007年，在西太平洋的雅浦群島出現首次寨卡病毒大范圍疫情；2015年3月，巴西發生史上最大規模的寨卡病毒暴發、流行，導致超過20萬例患者感染，隨后在南美洲迅速傳播；2016年2月1日，WHO宣布寨卡病毒感染疫情已成為“國際關注的突發公共衛生事件”，并于2016年11月18日將其轉為長期機制應對[2]。

2016年2月，我國發現首例輸入性寨卡病毒感染病例，隨后廣東、浙江、江蘇、北京、河南等省市陸續報道了輸入性病例，其中廣東省出入境人流量巨大，是我國最主要的流行地區[3]。如果不及時控制輸入性寨卡病毒疫情，極可能造成暴發、流行。根據寨卡病毒基因組序列的不同，將其分為亞洲型和非洲型，兩種亞型同源性在90%左右。亞洲型寨卡病毒可導致新生兒小頭畸形、成人GBS等嚴重疾病，尚未見非洲型寨卡病毒導致上述疾病的報道，我國目前分離的所有寨卡病毒株均為亞洲型，總體變異率不高[4]。

2 寨卡病毒檢測技術

2.1病毒分離培養 病毒分離培養是應用細胞組織培養技術從感染者血液、尿液、唾液、羊水、精液等各類標本中分離出病毒，被認為是實驗室檢測的“金標準”。寨卡病毒常用細胞培養、動物體內接種等方式進行分離。多種細胞系均適合于寨卡病毒的培養，如人胚腎細胞HEK293、非洲綠猴腎細胞Vero等。動物體內接種是最早應用的病毒培養方法，將病毒接種于易感動物的皮下、腹腔、顱內等部位，從而實現病毒的快速增殖，我國報道的首例寨卡病毒即采用乳鼠顱內接種得以成功分離[5]。然而，寨卡病毒屬于第3類病原體，其分離培養必須在二級生物安全實驗室進行，故普通實驗室難以開展。

80%以上的寨卡病毒感染為隱性感染，送檢的臨床標本中病毒載量往往偏低，需要經過多次培養傳代才可能分離到病毒。因此，病毒分離培養雖然特異度高，具有確診意義，但靈敏度低、操作復雜、耗時長，難以實現大批量標本的快速檢測，目前僅限于科研或其他鑒定方法的復核。

2.2血清學檢測

2.2.1單克隆抗體檢測 人體感染寨卡病毒3～5 d即可出現特異性IgM抗體，通過檢測IgM抗體可對病毒感染進行早期診斷。IgG抗體在血清中出現較晚，存在時間長，若IgG抗體檢測陽性則可判斷為再次感染或慢性感染。NS1蛋白是寨卡病毒7種非結構蛋白中唯一能以可溶性六聚體形式分泌至感染者外周血，在感染早期即可出現且存在時間長的蛋白。BOSCH等[6]采用重組NS1蛋白免疫小鼠篩選出一系列特異性抗體，建立了針對NS1抗原的快速檢測試紙，靈敏度和特異度可分別達81.0%、86.0%。KIM等[7]進一步研發出寨卡病毒首個單克隆抗體快速檢測試劑盒，作用靶點是E蛋白和NS1蛋白的IgG或IgM抗體，IgG抗體的檢測靈敏度和特異度分別為99.0%、99.3%，IgM抗體的檢測靈敏度和特異度分別為96.7%、98.7%，且與登革熱病毒IgG和IgM抗體的交叉反應率僅為16.7%、5.6%，可見該試劑盒使用簡便，且靈敏度和特異度均較高。我國學者向夢蓉等[8]設計的NS1抗原免疫層析膠體金試紙可成功區分寨卡病毒和登革熱病毒，同樣具有較高的靈敏度和特異度。單克隆抗體檢測技術日趨成熟，有望作為全球寨卡病毒流行地區的即時診斷和大規模篩查工具，但后期也仍需大量臨床樣本的持續驗證試驗。

2.2.2酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 根據ELISA原理的不同可分為間接法、競爭法、雙抗體夾心法等。ELISA檢測病毒感染的優點是成本低、易操作、對設備要求低、可廣泛應用于基層實驗室，故成為目前寨卡病毒最常見的血清學檢測方法。ELISA檢測寨卡病毒的特異性靶位主要集中于NS1蛋白和E蛋白。研究顯示，通過構建NS1基因的原核表達質粒，利用大腸桿菌表達重組NS1蛋白或構建NS1基因的真核表達載體，利用HEK293F細胞表達重組NS1蛋白純化蛋白后免疫小鼠，均能制備出高純度的抗NS1單克隆抗體[9-10]，這為建立ELISA檢測方法提供了基礎。

中國疾病預防控制中心的科研團隊[11]選取寨卡病毒4種抗原(E蛋白胞外區、NS1蛋白、C蛋白、rE Ⅲ蛋白)進行重組表達和純化，以間接法檢測相應的IgG抗體，發現E蛋白胞外區和NS1蛋白的檢測靈敏度和特異度均達到較高水平，適合作為寨卡病毒的靶抗原。此外，該團隊還發現以NS1蛋白作為檢測抗原，采用間接法檢測感染者血清、尿液和唾液標本中的IgA抗體，可以作為IgG抗體的替代指標[12]。新加坡生物工程與納米技術研究所的科研團隊[13]以單鏈DNA作為結合靶位點，建立了針對寨卡病毒NS1蛋白的ELISA雙抗體夾心法，具有極高的靈敏度，檢出限可低至0.1 ng/mL。

E蛋白是寨卡病毒感染和復制的必需蛋白質，參與病毒與宿主受體細胞的識別，具有3種不同結構域，包括β桶狀的Ⅰ區(E Ⅰ)、參與E蛋白二聚體形成的Ⅱ區(E Ⅱ)及具有免疫球蛋白樣結構的Ⅲ區(E Ⅲ)，其中E Ⅰ/E Ⅱ可作為鑒定寨卡病毒的特異性B細胞表位[14]。柳紅妙等[15]設計了一種檢測寨卡病毒E蛋白的非包被ELISA，該方法與聚合酶鏈反應(PCR)檢測結果基本一致，且與登革熱病毒無交叉反應，在抗寨卡病毒藥物篩選方面具有較強優勢。

除了常見的NS1蛋白和E蛋白的檢測外，國外學者利用多肽微陣列的篩檢方法發現寨卡病毒NS2b蛋白中1段20個氨基酸的多肽序列(NS2b-20)，用于ELISA檢測的靈敏度和特異度可達96.0%、95.9%[16]。以該段特異性抗原多肽序列作為靶抗原，我國學者王天禹等[17]建立了一種高通量、高靈敏度的熒光素酶聯免疫吸附試驗(LISA)，應用于寨卡病毒的IgG抗體檢測，為實現高通量自動化檢測提供了基礎，適合寨卡病毒感染的免疫學診斷與流行病學調查。此外，近期PAWLEY等[18]從巴西寨卡病毒感染者中分離出一種特異性抗體，可以直接結合寨卡病毒免疫顯性表位，從而設計出一種高效的ELISA檢測方法，適合多種體液標本檢測，如尿液、唾液、血清和全血，其中尿液標本無基質效應且采集方便，可作為優先檢測標本。由此可見，多種寨卡病毒靶抗原可以應用ELISA檢測，感染者的各類體液標本也適合作為檢測對象，有效拓展了血清學方法在病毒檢測中的應用。

2.2.3中和試驗 中和試驗是病毒與相應抗體結合后，失去對易感動物致病力的試驗方法，主要檢測待檢標本中病毒特異性中和抗體的水平。蝕斑減少中和試驗(PRNT)在檢測寨卡病毒中和抗體方面的應用較為廣泛。PRNT以使蝕斑數減少50%的血清稀釋度作為效價，在確認病毒陽性標本上更具特異性。NASCIMENTO等[19]報道PRNT尤其適合于寨卡病毒感染者恢復期標本的特異性檢測。因此，美國疾病控制和預防中心(CDC)建議寨卡病毒IgM抗體ELISA檢測陽性的血清標本應通過PRNT進行確認。

與病毒分離培養的優缺點相似，雖然PRNT特異度高，但試驗過程非常耗時、耗力。為了彌補PRNT這一不足，KOISHI等[20]研發了基于高通量圖像熒光的寨卡病毒中和試驗，該方法檢測速度更快，并實現了多標本同時檢測，可用于寨卡病毒感染的臨床診斷確認及臨床疫苗研究。

2.2.4其他血清學檢測技術 LAURI等[21]報道了一種用于診斷寨卡病毒感染的新型血清學方法，利用時間分辨熒光共振能量轉移(TR-FRET)，用兩種發色基團分別標記NS1蛋白和細菌L蛋白，再與特定分子蛋白結合。這種基于熒光共振能量轉移(FRET)的血清學方法適用于診斷寨卡病毒感染，并易與其他黃病毒感染進行鑒別。此外，還有研究報道可通過流式細胞術鑒定血清中的寨卡病毒中和抗體[22]。

2.3核酸檢測

2.3.1反轉錄-PCR(RT-PCR) 寨卡病毒感染者血液、尿液、唾液、精液、羊水或胎盤組織等標本中均可檢出病毒RNA[23]。不同類型標本檢出時間各有不同，血清在病毒感染后7 d內可被檢出，尿液為20 d內，精液可長達60 d。RT-PCR技術是從核酸水平檢測病毒RNA，相對于病毒分離培養，鑒定周期縮短。在患者感染早期，特別是臨床癥狀出現的1周內，若檢測到寨卡病毒RNA即可快速確診[24]。但常規RT-PCR首先需要對病毒RNA進行反轉錄，再進行目標基因擴增，最后通過凝膠電泳分析擴增產物，該方法操作較為煩瑣，只能對擴增產物進行半定量分析，且易被污染，假陽性率偏高，目前已逐步被其他PCR技術代替。

2.3.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR) RT-qPCR采用插入特異性熒光探針，實現對病毒RNA的定量分析，具有操作簡便，靈敏度、特異度高等特點，無需對擴增產物進行后續分析，故可有效避免人為操作帶來的污染，與常規RT-PCR相比，極大提高了檢測效率。在巴西東南部寨卡病毒流行區域，AYRES等[25]通過RT-qPCR在埃及伊蚊、白紋伊蚊和庫蚊中檢測出寨卡病毒RNA，直接證實了蚊媒傳播是寨卡病毒感染的主要途徑。

RT-qPCR根據采集熒光方法的不同主要分為染料法和探針法。染料法是利用某些熒光染料(如SYBR Green)與雙鏈DNA結合后熒光強度明顯增強，從而被熒光檢測器檢出。XU等[26]通過優化基于SYBR Green探針的PCR引物設計后，實現了RT-qPCR一步法檢測寨卡病毒RNA，甚至可以檢測低至1 PFU/mL滴度的寨卡病毒。探針法是能與目的片段特異性結合的熒光探針，用相應酶水解探針后釋放熒光，從而實時定量擴增產物，最為常用的是TaqMan探針。JUDICE等[27]通過研發一種新型TaqMan探針，使RT-qPCR在檢測寨卡病毒NS5基因方面達到更高的靈敏度，并且在血液和尿液標本中的檢測結果高度一致。實驗室內部核酸交叉污染可能導致檢測結果呈假陽性，為了提高寨卡病毒核酸檢測的準確性，也可對E基因、NS5基因等多個分子靶位同時進行檢測，以涵蓋寨卡病毒多個譜系。

趙航等[28]通過分析寨卡病毒全基因組核酸序列，以NS5基因片段設計特異性引物，構建重組質粒，建立了基于RT-qPCR的寨卡病毒核酸檢測的高靈敏度方法，且該方法與登革熱病毒、丙型肝炎病毒無交叉反應。此外，針對亞洲型和非洲型寨卡病毒，我國學者根據兩種亞型病毒基因組序列特征，分別設計了相應的RT-qPCR檢測技術，實現了對病毒載量的絕對定量，可有效用于感染者的病原分型、早期診斷[29]。

針對RT-qPCR在極低寨卡病毒載量檢測方面的不足，南方醫科大學研究團隊[30]研發了一種微滴式數字PCR，在極低病毒載量的臨床標本中也表現出較高的靈敏度和特異度。此外，廣東醫科大學研究團隊[31]對PCR操作過程進行簡化，自主研發了直接反轉錄定量PCR(dirRT-qPCR)，無需對標本進行預處理，可直接檢測臨床標本中的寨卡病毒RNA，檢測限可低至95個RNA，且標本量僅需5 μL。此外，dirRT-qPCR具有高通量和即時診斷的能力，還可以擴展用于其他病毒檢測，顯現出床旁檢測及快速現場篩查的巨大潛力。

2.3.3其他基因擴增技術 近年來，在傳統RT-PCR基礎上，科學家們研發出了一系列高效、靈敏的基因擴增技術，如鏈侵入式擴增技術、環介導恒溫擴增(LAMP)技術等，其中又以LAMP技術應用較為廣泛。LAMP技術是在單一恒定溫度下(通常為65 ℃)，使用4～6個引物，通過鏈置換DNA聚合酶快速擴增獲得新DNA，在1 h內即可完成檢測[32]，且該方法僅需一臺普通加熱儀，可用于快速檢測及在一些資源匱乏地區對病毒的實時監測。鐘響等[33]針對寨卡病毒NS5基因設計并篩選的LAMP引物可在64 ℃ 50 min內特異性擴增NS5基因，并且與基孔肯雅熱病毒、登革熱病毒、黃熱病毒均無交叉反應，檢測限達10 copy/μL，是普通PCR的100倍，可見改進后的LAMP技術的靈敏度得到大幅提升。近期，ESTRELA等[34]在Bst DNA聚合酶基礎上，進一步優化LAMP技術檢測條件，將寨卡病毒檢測時間縮短至10 min。對于寨卡病毒感染的急性期，CASTRO等[35]報道還可通過LAMP技術檢測感染者唾液標本，從而實現快速診斷。

2.4生物傳感器檢測 生物傳感器是一種將生物元件與被測物質相互作用所產生的物理化學效應轉變為電信號進行檢測的儀器。隨著計算機軟件模擬技術的迅速發展，生物傳感器技術已擴展到了病毒早期診斷的領域。MOCO等[36]使用石墨電極平臺研發了一種電化學生物傳感器，檢測寨卡病毒RNA僅需20 min，檢測限達1.72 copy/mL，且該傳感器在60 d內均具有良好的穩定性。也有學者使用表面印跡聚合物和氧化石墨烯復合材料，研發出新型寨卡病毒電化學生物傳感器，檢測限甚至可達到RT-qPCR的水平[37]。有文獻報道了一種基于芯片的電位傳感器，采用3D分子印跡技術可快速檢測緩沖液中低至10 PFU/mL滴度的寨卡病毒[38]。

此外，針對寨卡病毒NS1蛋白，TAKEMURA等[39]研發出一種等離子體共振放大免疫熒光生物傳感器，可實現快速檢測。類似研究中，ZHANG等[40]還報道了一種基于生物檢測信號的新型乳液凝集試驗，該試驗簡便、廉價，適合于寨卡病毒NS1蛋白的現場檢測。

3 結 語

寨卡病毒是黃病毒屬中第一個被報道能通過母嬰傳播、性傳播的病毒。目前國內外尚無抗寨卡病毒感染的靶向藥物，病毒疫苗也仍處于臨床試驗階段。因此，建立經濟、快速、特異度高的寨卡病毒檢測方法，對病毒感染的早期診斷尤為重要。病毒分離培養雖然是實驗室檢測的“金標準”，但培養要求高，應用極為局限，常規條件下難以開展，故普通實驗室多通過血清學或核酸檢測寨卡病毒感染。血清學方法操作簡便、成本低廉、易于推廣，但仍存在一定程度的假陰性及與其他黃病毒屬的交叉反應，故常將其與PCR技術聯合應用，從而提高寨卡病毒的診斷效能。新興的生物傳感器技術，雖然初期檢測寨卡病毒靈敏度方面與PCR技術相比尚有一定差距，但隨著該技術的日益發展，目前其檢測限已達到實驗室的常規要求，且其快速和高通量檢測潛力是常規方法無法比擬的，應用空間極為廣闊，有望取代現有的主流檢測技術。隨著病毒檢測技術及病毒基因組學的蓬勃發展，寨卡病毒在不遠的將來也能實現可預防、可控制、易治療。