重組桿狀病毒載體在基因治療中的應用*

廖致紅,代小麗，吳春鳳，劉志華，李麗敏，徐 鵬 綜述，沈開元審校

(廣西壯族自治區柳州市人民醫院檢驗科,廣西柳州 545006)

基因治療指利用基因轉移技術將外源正常基因導入靶細胞，使外源基因的產物補償基因缺陷或糾正基因異常，從而治療疾病的方法。外源基因導入靶細胞的方法有很多，基因治療載體的研究從反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒等病毒載體發展到如今的人工染色體載體、細菌載體、桿狀病毒等新的載體。但是實現外源基因長期穩定的表達、靶向性的表達還需進行更多的探索和研究[1]。本文對近年來重組桿狀病毒基因治療載體的研究以及其在癌癥基因治療中的應用進行總結。

1 重組桿狀病毒及其表達系統

桿狀病毒是一種環狀、閉合雙鏈DNA病毒，基因組大小為80～160 kb[2]，編碼90～180個蛋白，在已測序的桿狀病毒中發現31個核心基因[3]。根據包涵體的形態和病毒誘導的細胞病理學特征，桿狀病毒分為核多角體病毒屬(NPV)和顆粒病毒屬(GV)[4]。

重組桿狀病毒表達系統是一種利用桿狀病毒為載體，在昆蟲培養細胞或蟲體中表達外源蛋白的真核表達系統。重組桿狀病毒表達系統由轉移載體、親本病毒和重組介質3個部分組成，重組病毒的構建過程如下：將目的基因克隆到轉移載體，將載體與親本病毒同時導入宿主細胞，目的基因通過同源重組替換桿狀病毒非必需片段形成重組病毒，病毒在宿主細胞內大量復制時，目的基因也得到表達[2]。該技術是一項成熟、安全、經濟、高效的蛋白質表達技術。

2 重組桿狀病毒在癌癥基因治療中的應用

根據治療基因進入癌細胞后的不同效應，將重組桿狀病毒介導的癌癥基因治療方法分為3種。第一種方法是治療基因進入癌細胞能夠加強機體對惡性增生癌細胞的免疫應答，并清除癌細胞。其方法就是利用重組桿狀病毒將癌細胞特異性抗原導入機體，隨后激活機體自身的T淋巴細胞的識別作用，進而清除癌細胞[5]。有研究者利用動物模型，通過重組桿狀病毒攜帶CD40配體和白細胞介素(IL)-15基因治療膀胱癌，發現兩種基因的導入可以顯著增加膀胱組織單核細胞，CD4+、CD8+和γδ T淋巴細胞的浸潤性，明顯延長動物的生存期(治療組>12個月，對照組<2個月)，且端粒反轉錄酶基因在癌細胞和正常細胞中的表達差異有統計學意義(P<0.05)[6]。據此KIM等[7]構建了包含端粒反轉錄酶基因的重組桿狀病毒載體，并以高劑量接種被植入膠質瘤瘤體的小鼠，隨后在實驗組小鼠的體內觀察到大量分泌干擾素(IFN)-γ的T淋巴細胞，而且實驗組小鼠自然殺傷(NK)細胞的活性也顯著高于對照組小鼠。重組桿狀病毒中載入IFN-β基因后轉導Lewis肺癌(LL)細胞可導致體外惡性表型減少，抑制上皮-間質轉化(EMT)相關蛋白的表達[8]。美國食品藥物監督管理局(FDA)在2009年批準的Cervarix疫苗也是利用重組桿狀病毒表達系統生產的攜帶人乳頭瘤病毒(HPV)16、18型L1蛋白的病毒樣顆粒[9]。這些研究結果表明，重組桿狀病毒能夠攜帶病毒抗原蛋白或腫瘤特異性蛋白基因，并在哺乳動物細胞成功表達，激活機體自身的免疫系統來消滅病毒或清除癌細胞。

第二種是將“自殺基因”導入癌細胞，以此實現治療癌癥的目的。WANG等[10]利用神經膠質細胞特異性啟動子在膠質瘤細胞中表達白喉毒素A，聯合胞內注射可以實現較高的治療有效率(96%)。利用重組桿狀病毒載體表達單純皰疹病毒胸苷激酶，其可在抗皰疹病毒藥物更昔洛韋存在的情況下，誘導惡性膠質瘤細胞死亡，從而達到治療惡性膠質瘤的目的[11]。

第三種方法是將正常基因導入癌細胞中，以此來糾正癌基因或修復抑癌基因，阻止癌細胞增殖，并誘導其死亡。2001年SONG等[12]運用重組桿狀病毒攜帶人p53基因治療骨肉瘤，重新導入p53基因的細胞對化療藥物更敏感，因此聯合阿霉素，其治療有效率(95%)顯著高于單獨使用阿霉素(55%)，這種聯合治療方法為臨床應用打下了良好的基礎。隨后一些組蛋白乙酰化酶抑制劑，例如丁酸鈉、曲古抑菌素A、丙戊酸等也被用作重組桿狀病毒攜帶p53基因的聯合治療藥物。另一種抑癌基因——正常上皮細胞特異性因子1也在重組桿狀病毒表達系統的作用下顯著抑制胃癌細胞的增殖，瘤內注射后有效率可達42.3%[13]。Apoptin蛋白是一種能夠誘導凋亡的蛋白，且特異性地存在于惡性增生的癌細胞中。將Apoptin基因連入桿狀病毒載體后導入機體，只有癌細胞發生凋亡，正常細胞并不受影響，且瘤內注射該重組載體能夠顯著縮小肝癌細胞的體積[14]。Rta蛋白是EB病毒由潛伏期轉向裂解期的關鍵性調控因子，其與桿狀病毒構成的重組桿狀病毒能顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖[15]。另外，將靶向的短發夾RNA利用重組桿狀病毒導入癌細胞是另一種具有應用前景的基因治療方法[16]。

3 桿狀病毒作為基因治療載體的優勢

作為基因治療過程中運輸治療基因的工具，目前常用的轉移基因的方法分為非病毒載體系統和病毒載體系統[17]。非病毒載體系統具有毒性小、安全性高、外源基因長度不受限制的優點，但由于人體生理屏障和載體本身的特性，其較低的感染效率和更短的目的基因持續表達時間限制了臨床應用。

臨床基因治療使用的病毒載體主要來源于反轉錄病毒(RV)、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒等，但均具有明顯的缺陷。相比而言，桿狀病毒作為真核生物表達載體，其在攜帶治療基因、表達外源蛋白方面的優勢表現在以下幾個方面：(1)桿狀病毒具有很高的宿主特異性，專一寄生于無脊椎動物，對于人體來說，安全性高于上述病毒載體；(2)桿狀病毒載體容量大，且多啟動子技術可使載體能夠同時表達多種蛋白[18]；(3)桿狀病毒基因組中的ph/p10基因具有強啟動子，可用于完成目的基因的高效轉錄[19]；(4)昆蟲細胞可對外源蛋白進行翻譯后修飾，保證了蛋白的生物活性[20]；(5)桿狀病毒不會在哺乳動物細胞中復制，也不在這類細胞中增殖和擴散，故不會刺激哺乳動物產生強烈的免疫應答[3]。基于上述優點，桿狀病毒載體在基因治療方面具有良好的應用前景。

4 重組桿狀病毒在基因靶向治療中面臨的問題

重組桿狀病毒攜帶的治療基因在哺乳動物細胞中能否高效表達，是其臨床應用面臨的一項巨大挑戰。桿狀病毒不能在哺乳動物細胞中復制，但在某些哺乳動物細胞內，在活性的啟動子控制下，外源目的基因能夠被高效轉錄和穩定表達。這一特性為桿狀病毒應用于哺乳動物創造了條件，HOFMANN等[21]在1995年利用了重組AcNPV為載體，在CMV啟動子作用下，使外源基因在肝細胞中得以表達。另外，重組桿狀病毒載體的表面修飾也是提高外源基因作用效應的方法，將RGD肽與桿狀病毒的囊膜糖蛋白GP64融合，可以大大提高載體的轉導效率[22]。同樣，將水皰性口炎病毒膜蛋白G連入重組載體，也能在體內外試驗中提高重組桿狀病毒表達系統的轉導效率[23]。MKEL等[24]將LyP-1、F3以及CGKRK腫瘤靶多肽分別載入桿狀病毒表達系統，導入人乳腺癌細胞和肝癌細胞后，發現這些經過表面修飾載體的效率高于未修飾載體的2～5倍。

另一限制重組桿狀病毒體內轉導效率的因素為該病毒對體內補體反應的不耐受性。重組桿狀病毒作為一個病毒載體，能夠激活機體的補體系統，導致病毒不能發揮作用，且無法裂解癌細胞，這大大降低了該病毒的作用效果。為了規避體內補體反應，將人衰變加速因子與GP64蛋白融合，可使重組桿狀病毒載體具有抗補體作用，并且不干擾病毒的復制[25]。

除了上文提到的提高載體轉導效率、規避補體系統反應等問題，重組桿狀病毒對相應癌細胞的靶向性也是在投入臨床使用之前必須解決的問題。尋求更多具有組織特異性表達的啟動子和microRNA是推廣這一技術的根本所在，這需要科研工作者付出更多的努力。

5 重組桿狀病毒在基因治療領域的應用前景

自人類于20世紀80年代利用桿狀病毒表達系統表達人干擾素后，經過三十多年的發展，桿狀病毒表達系統已經與大腸桿菌、酵母等表達系統齊名，廣泛應用于基礎研究、基因治療、疫苗制備、單克隆抗體生產以及生物防治等多個領域。2004年4月由我國自主研發的重組人p53腺病毒注射液獲得國家食品藥品監督管理局批準上市并正式應用于臨床，這意味著利用基因治療惡性腫瘤成為可能。重組桿狀病毒為生物技術廣泛應用的一種有力載體，盡管其在基因治療過程中存在各種各樣的問題，但是其具有的攜帶DNA容量大、可操作性好、可同時表達多個外源基因等優點，使其充當的基因傳遞系統這一角色具有不可替代的作用，今后將有更多有效的治療基因會通過重組桿狀病毒實現其臨床應用。