江西地區(qū)育齡女性HCY 水平及其亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性分析

徐永華，劉艷秋，張兆振，趙鳳

（江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南昌330006）

出生缺陷是一個全球性問題,尤其在發(fā)展中國家，我國出生缺陷高達(dá)5.6%，每年新增出生缺陷數(shù)約為90 萬例，而葉酸攝入不足或者不能被有效吸收利用是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因之一[1]。因此孕婦體內(nèi)需攝入足夠的葉酸營養(yǎng)來應(yīng)對自身健康和胎兒生長發(fā)育的需要。 同型半胱氨酸（ HCY）是人體內(nèi)一種含硫氨基酸， 是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程的中間產(chǎn)物， 亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是參與葉酸轉(zhuǎn)運和代謝的關(guān)鍵酶，其堿基突變會引起酶活性的改變， 導(dǎo)致5-甲基四氫葉酸合成不足，引起葉酸代謝異常，使得HCY 向蛋氨酸轉(zhuǎn)換障礙，這樣導(dǎo)致體內(nèi)HCY 聚集。 高HCY與出生缺陷如神經(jīng)管缺陷（NTDs）、唇腭裂等以及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、妊高癥、妊娠期糖尿病等疾病密切相關(guān)[2-5]。 因此我們通過對江西地區(qū)育齡女性HCY 水平及MTHFR C677T 基因型的測定，以了解本地區(qū)HCY 水平與葉酸代謝基因MTHFR C677T 基因型相關(guān)性，從而制定個體化葉酸補(bǔ)充方案，指導(dǎo)育齡女性合理補(bǔ)充葉酸， 為預(yù)防出生缺陷提供個體化干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2213例2018年9 月-2019年5月間在本院進(jìn)行孕前或孕期葉酸代謝檢測的育齡女性，年齡17-48歲,分別空腹采集3-4ml 黃色分離膠管靜脈血，2h 內(nèi)3000r/5min 離心檢測，不能完成檢測的標(biāo)本2-8℃冷藏保存，2d 內(nèi)完成檢測；采集靜脈血2-3ml 注入EDTA-K2 抗凝管中混勻。

1.2 儀器與試劑 HCY 水平檢測儀器為生化儀頤蘭貝ES-200， 試劑為安圖生物有限公司生產(chǎn)；MTHFR C677T 基因型檢測所用到的檢測試劑盒、DNA 提取試劑盒、BR-526-24 全自動雜交儀、生物芯片讀取儀以及PCR 儀均來自上海百傲科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HCY 采用循壞酶法檢測 成人HCY 參考范圍：0-15μmol/L 。

1.3.2 DNA 提取擴(kuò)增 使用DNA 提取液提取200μml 全血中的DNA, 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，MTHFR C677T 擴(kuò)增液22μl,反應(yīng)液A 1Μl,基因組DNA 2μl； 在50℃5min；94℃5min；94℃25s，72℃25s 的擴(kuò)增條件下35 個循環(huán)；72℃5min，同時設(shè)置陰陽性對照物，獲取的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)。

1.3.3 采用PCR-芯片雜交法檢測MTHFR C677T基因多態(tài)性，根據(jù)百傲試劑說明書方法進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交結(jié)果采用生物芯片讀取儀讀取，根據(jù)芯片圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析樣本基因型， 其基因型分為：野生型（CC 型）、雜合突變型（CT 型）和純合突變型（TT 型）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗對人群基因型進(jìn)行分析， 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)值以百分率表示，采用卡方檢驗比較組間差異；計數(shù)量值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t 檢驗比較組間差異，以P＜0.05 為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 育齡女性不同年齡組HCY 水平與MTHFR C677T 基因型分析 2213 名育齡女性根據(jù)年齡分為≤35 歲（低齡組）和＞35 歲（高齡組）2 組，低齡組HCY 水平為（10.47±2.67）μmol/L，高齡組HCY 水平為（10.41±3.51）μmol/L，低齡組MTHFR C677T基因型分布情況：CC 型39.3%（117/298）、CT 型47.6%（142/298）、TT 型13.1%（39/298）， 高 齡 組MTHFR C677T 基因型分布情況：CC 型39.4%（755/1916）、CT 型45.3%（868/1916）、TT 型15.2%（292/1916）。 結(jié)果顯示： 兩不同年齡組育齡女性HCY 水平比較（t 值=-0.403，P=0.34），兩不同年齡組育齡女性MTHFR C677T 基因型比較 （χ2=1.11,P＞0.573）。 提示兩組育齡女性HCY 水平及MTH FR C677T 基因型比較無統(tǒng)計學(xué)差異。 見表1。

表1 不同年齡組HCY 水平及其MTHFR C677T 基因型分布

2.2 育齡女性MTHFR C677T 基因型與等位基因頻率分布情況分析 2213 名育齡女性MTHFR C677T 基因型分別為野生型CC 型39.4%（872/2133）、雜合突變型CT 型45.6%（1010/2133）、純合突變型TT 型15%（331/2213），等位基因C、T 的檢出 頻 率 分 別 為62.2%（2754/4426）、37.8%（1672/4426）,符合H-W 遺傳平衡，樣本具有區(qū)域群體代表性。

2.3 MTHFR C677T 不同基因型的HCY 水平情況2213 名育齡女性血清HCY 水平（10.46±2.8）μmol/L,高值（＞15μmol/L）88 例，占總數(shù)3.97%。 MTHFR C677T 基因型分為野生型（CC 型）872 例，HCY 水平為（9.9±1.9）μmol/L、 雜合突變型（CT 型）1010例，HCY 水平為（10.33±2.34）μmol/L、純合突變型（TT 型）331 例，HCY 水平為（12.37±4.6）μmol/L。結(jié)果提示：3 組MTHFR C677T 不同基因型的HCY水平有顯著差異,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均=0.000），異常值表現(xiàn)為TT 型＞CT 型＞CC 型，差異有統(tǒng)計學(xué)（P 均＜0.005）。 見表2。

表2 MTHFR C677T 不同基因型的HCY 情況

2.4 本地區(qū)MTHFR C677T 基因型分布與全國其他地區(qū)比較 本組與MTHFR C677T 基因型及其等位基因分布與武漢、湖州、云南等地報道數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與河北、鄭州、山東、山西、南寧、瓊海、江門等地統(tǒng)計數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果提示：各地區(qū)MTHFR C677T 基因型及等位基因分布有南北差異，呈現(xiàn)北高南低。 大部分地區(qū)MTHFR C677T 基因型分布以CT 型為主， 但是其中南寧、瓊海、江門以CC 型為主。 見表3。

3 討論

MTHFR 是葉酸代謝過程的關(guān)鍵酶，其多態(tài)性與出生缺陷疾病密切相關(guān)[6]，MTHFR C677T 位點是我國人群常見的多態(tài)性位點， 該位點突變導(dǎo)致酶活性下降可引起葉酸水平降低和HCY 水平升高。有研究結(jié)果表明,母親為CT 型攜帶者其子代發(fā)生神經(jīng)管缺陷（NTDs）的風(fēng)險為CC 型母親攜帶者子代的2.06 倍， 母親為TT 型攜帶者其子代發(fā)生NTDs 的風(fēng)險為CC 型母親攜帶者子代的3.12 倍[7]。

研究結(jié)果顯示：HCY 水平在超過35 歲的高齡組和35 歲以下的低齡組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這一結(jié)果與宋妙麗等[8]結(jié)果一致，但與李杰等[9]的結(jié)果不同，可能與其研究樣本量較少有關(guān)，我們的結(jié)果還顯示，兩組年齡組MTHFR C677T 基因型分布比較無統(tǒng)計學(xué)差異。但是3 組MTHFR C677T 基因型的HCY 水平和異常值率比較差異顯著，（P均=0.000）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且表現(xiàn)為TT 型＞CT型＞CC 型。 說明HCY 水平與MTHFR C677T 基因型有相關(guān)性,這一點符合文獻(xiàn)報道[7]，進(jìn)一步證實了MTHFR C677T 基因突變可能導(dǎo)致高HCY 血癥。

表3 本地區(qū)MTHFR C677T 基因型及等位基因的分布與其他區(qū)域的比較

大量研究表明，MTHFR C677T 基因型分布具有地域差異,我們統(tǒng)計了武漢、湖州、瓊海等10 個地區(qū),分析發(fā)現(xiàn),江西地區(qū)與武漢、湖州、云南等地報道數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,與河北、鄭州、山東、山西、南寧、瓊海、江門等地統(tǒng)計數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義, 結(jié)果提示: 各地區(qū)MTHFR C6 77T基因型及等位基因分布有南北差異， 呈現(xiàn)北高南低。 大部分地區(qū)MTHFR C677T 基因型分布以C T型為主,但是其中南寧、瓊海、江門以CC 型為主。

增補(bǔ)葉酸已逐漸成為成為全球干預(yù)出生缺陷有效措施，但是增補(bǔ)葉酸存在地域和人群的差異，況且葉酸增補(bǔ)過多也會帶來意外風(fēng)險和負(fù)面影響[10]。為育齡女性制定個性化的葉酸增補(bǔ)方案是臨床的一個發(fā)展趨勢，因此，有必要針對育齡女性進(jìn)行HCY 水平和MTHFR C677T 基因型的檢測， 根據(jù)HCY 水平、 葉酸及MTHFR C677T 基因型檢測結(jié)果，并結(jié)合孕產(chǎn)史，飲食結(jié)構(gòu)等綜合評估葉酸代謝能力，為育齡女性補(bǔ)充葉酸提供合理化建議，已期達(dá)到降低出生缺陷的目的。