鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移患者Zta 蛋白表達與EB-DNA檢測相關(guān)性研究＊

鄒嵩，汪琛

（江西省贛州市人民醫(yī)院，1.微創(chuàng)介入科；2.腫瘤科，贛州341000）

鼻 咽 癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)在 我國屬于常見惡性腫瘤， 其發(fā)病存在一定的地域因素，多發(fā)于廣東、江西、廣西等地，其中70%-80%的患者初診就合并頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)， 更為嚴(yán)重的是，有6%-15%的患者初診時即出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移[1-4]。鼻咽癌與EB 病毒（EBV）存在著密切的關(guān)聯(lián)，存在研究表明[5]，在NPC 患者的早期診斷、臨床分析和監(jiān)測療效、 復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移以及預(yù)后預(yù)測中， 血漿EBV-DNA 檢測都具有其重要的臨床價值。 Zta 蛋白是EBV 立即早期基因BZLF1 編碼的蛋白，該蛋白通過調(diào)控病毒基因使病毒順利的復(fù)制、 包裝、感染，同時Zta 也調(diào)控了細(xì)胞內(nèi)基因，影響了細(xì)胞增殖、生長、分化、凋亡，并且能夠使得裂解感染期基因瘋狂表達，使得鼻咽部上皮細(xì)胞產(chǎn)生癌變[6]。 目前， 已存在一些關(guān)于EB-DNA 檢測對鼻咽癌診斷價值的研究，但在Zta 蛋白方面的研究較少。 本研究通過明確鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移患者血清EBV-DNA 與Zta 蛋白表達的關(guān)系，進而探討一種治療EBV 感染疾病時針對Zta 蛋白的靶向治療方法， 為EBV 感染以及針對Zta 蛋白的靶向治療方法奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017 年6 月-2019 年6 月間我院診斷為初治鼻咽癌的患者40 例納入本研究，其中男26 例，女14 例；年齡20-70 歲，平均（47.35±10.17） 歲； 腫瘤最大徑：≤3cm 者29 例，＞3cm 者11例； 轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目：≤3 個者31 例，＞3cm 者9 例；未分化非角化鱗癌6 例、低分化鱗癌15 例、中分化鱗癌19 例；Child-Pugh 分級[7]：A 級32 例、B 級8例。 納入標(biāo)準(zhǔn)：鼻咽癌患者并于我院經(jīng)影像學(xué)檢查確診發(fā)生肝轉(zhuǎn)移患者；腫瘤最大徑≤5cm；肝轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)≤5 個；知情并簽署知情同意書。 本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法 外周血EBV-DNA 檢測：清晨采集鼻咽癌患者外周靜脈血3mL， 并用1500r 離心機離心10 min，吸取離心后上層血漿，隨后按DNA 提取試劑盒指示操作，提取的DNA 加入緩沖液至-20℃冰箱保存，用熒光定量PCR 儀（美國ABI 7900）檢測EBV-DNA 表達。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測：實驗血清樣本采用含2%小牛血清的磷酸緩沖鹽溶液稀釋，Zta-IgG 和Zta-IgA 的檢測濃度分別為1：200 和1：20，隨后在每孔種加入100μl 稀釋血清。 在37℃下孵育1h， 經(jīng)緩沖液沖洗5 遍后再加入標(biāo)記后的IgG和IgA 抗體，再次孵育、沖洗，加入顯色劑37℃顯色15min，終止顯色后用酶標(biāo)儀（Thermo Scientific Varioskan LUX）檢測吸光度。

1.3 觀察指標(biāo) 比較不同性別、 不同腫瘤最大徑、不同轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目以及不同分級患者EBV-DNA 拷貝數(shù)；統(tǒng)計患者Zta-IgG 和Zta-IgA 的相對光密度值，并分析其與EBV-DNA 水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件建立完整數(shù)據(jù)庫， 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表達，用t 檢驗法進行比較，對鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移進行多因素分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 EBV-DNA 拷貝數(shù)差異情況 男性患者、腫瘤最大徑＞3cm、轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目＞3 以及Child-Pugh 分級為B 級的患者EBV-DNA 拷貝數(shù)略高于女性、腫瘤最大徑≤3cm、轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目≤3 以及分級為A 級的患者,差異無明顯差異(P＞0.05),見表1。

2.2 鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移多因素分析 分析結(jié)果顯示，腫瘤最大徑＞3cm、轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目＞3 以及Child-Pugh 分級（B 級）是鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移患者的危險因素，（OR＞1，P＜0.05），詳見表2。

表1 患者一般資料EBV-DNA 拷貝數(shù)差異比較

表2 鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移多因素分析

2.3 患者zta 蛋白表達與EBV-DNA 水平的相關(guān)性分析 患者Zta-IgG 和Zta-IgA 的相對光密度分別為（1.63±1.04）和（1.71±1.07），相關(guān)性分析結(jié)果顯示Zta-IgG、Zta-IgA 與EBV-DNA 水平均為正相關(guān)（r=0.187，P=0.023；r=0.213，P=0.017），見表3。

表3 患者zta 蛋白表達與EBV-DNA 水平的相關(guān)性

3 討論

大部分NPC 患者癌細(xì)胞中均檢測存在EBV基因組成分，并且有研究表明[8]NPC 患者外周血中EBV-DNA 水平會隨腫瘤消長而發(fā)生變化，EBVDNA 檢測能有效監(jiān)測NPC 的發(fā)生、發(fā)展情況。 Lin等[9]通過比較99 例NPC 患者血漿和原發(fā)腫瘤的EBV 基因型，并且對PCR 產(chǎn)物進行測序，從而證實了整合了EBV 的鼻咽癌細(xì)胞是血漿EBV-DNA 的主要來源。Wang 等[10]通過PET-CT 結(jié)合EBV-DNA檢測對經(jīng)過治療后的NPC 患者進行了隨訪， 發(fā)現(xiàn)治療后血漿中可檢測到EBV-DNA 水平的36 患者均出現(xiàn)了NPC 復(fù)發(fā)， 而未檢測到EBV-DNA 水平的5 例患者均未出現(xiàn)NPC 的復(fù)發(fā)， 并且該方法的靈敏度優(yōu)于PET-CT。 與治療前血漿EBV-DNA 水平相比， 治療后EBV-DNA 水平對于NPC 的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有更大的預(yù)測意義， 尤其是治療后患者血漿EBV-DNA 水平能否及時降到0 直接關(guān)系到NPC 的復(fù)發(fā)[11]。 并且，有相關(guān)研究表明EBV-DNA水平與我國2008 TNM 分期呈正相關(guān)。 目前，有關(guān)于EBV-DNA 具體的入血機制尚未完全被人們了解，但以下兩種機制被大多數(shù)人接受：其中一種機制認(rèn)為，血漿EBV-DNA 水平與腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，在細(xì)胞凋亡時，DNA 通常被脫氧核苷酸酶切割裂解，形成181 bp 以內(nèi)的小片段，故猜想其入血與細(xì)胞凋亡裂解可能存在一定的關(guān)聯(lián)；另一種機制認(rèn)為，EB 病毒通過潛伏周期轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙鈴?fù)制周期以后，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)、周期，染色體變化以及宿主細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的免疫識別均會產(chǎn)生較大的影響[12]。

EBV 在裂解期所表達的病毒蛋白可分為立早蛋白、早期蛋白以及晚期蛋白3 類。 其中，早期蛋白與病毒DNA 復(fù)制有關(guān)，晚期蛋白與病毒包裝有關(guān)，而立早蛋白則主要負(fù)責(zé)前2 種蛋白的轉(zhuǎn)錄，在EBV 進入裂解期起著關(guān)鍵的作用。 Zta 蛋白就是EBV 立早基因BZLF1 編碼的蛋白， 同時也是最重要對的立早蛋白之一， 并且該蛋白能夠促進早期和晚期蛋白的瘋狂轉(zhuǎn)錄表達， 使得EBV 由潛伏期進入裂解期[13]。 近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，Zta 蛋白不僅僅會影響病毒蛋白的表達， 甚至通過多途徑影響著宿主蛋白的表達。 一方面， 該蛋白具有螺旋結(jié)構(gòu)，可與宿主細(xì)胞蛋白發(fā)生作用；另一方面，該蛋白與AP1 家族具有同源性， 能夠與宿主細(xì)胞基因啟動子發(fā)生結(jié)合，進而影響宿主細(xì)胞蛋白的表達、轉(zhuǎn)錄[14,15]。

本研究對鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移患者一般資料EBVDNA 拷貝數(shù)進行比較， 結(jié)果提示鼻咽癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移后，在腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目、腫瘤最大徑之間存在差異時，其EBV-DNA 拷貝數(shù)并無明顯差異（P＞0.05）， 而有研究顯示未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者EBV-DNA 拷貝數(shù)明顯低于轉(zhuǎn)移患者。 而多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤最大徑＞3cm、 轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目＞3 以及Child-Pugh分級（B 級）均是鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移患者的危險因素，并且相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Zta 蛋白表達與EBVDNA 水平呈正相關(guān)， 可見患者Zta 蛋白與EBVDNA 水平均可作為評價鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

綜上所述，Zta 蛋白和EBV-DNA 水平均可作為診斷EBV 感染的指標(biāo)，在臨床上對于EBV 的預(yù)防與治療具有較高的應(yīng)用價值。