染色體微陣列分析在神經系統發育異常胎兒中的應用

譚玲瓏,劉艷秋,黃婷婷,鄒永毅

(江西省婦幼保健院產前診斷中心，南昌330006)

胎兒神經系統發育異常是最常見的先天性畸形之一，主要包括側腦室增寬、腦積水、全前腦、無腦兒、 脈絡叢囊腫、 小腦延髓池增寬、Dandy—walker 綜合征、胼胝體發育不良、顱內腫瘤、顱后窩結構畸形等。 導致畸形的病因可分為遺傳性因素、感染性因素、化學性因素或環境因素等[1]。 目前，應用于檢測胎兒畸形的常見染色體檢查方法主要是傳統G 顯帶染色體核型分析[2]。 然而，G 顯帶染色體核型分析僅能檢出非整倍體染色體數目異常和較大片段的結構異常， 即使利用高分辨顯帶技術也僅限于檢出4-5Mb 以上的染色體異常[3]。 并不能檢出染色體微缺失和微重復，然而微缺失和微重復與胎兒神經系統發育異常具有相關性。染色體微陣列分析技術 (Chromosome Microarray Analysis,CMA)是新近出現的用于檢測染色體微缺失和微重復的一項技術， 能將染色體拷貝數變異 （ copy number variations, CNVs）檢出率提高到10% 以上[4,5]。 與傳統染色體核型分析技術相比，CMA 分辨率高，能檢出大于400kb 的CNVs，準確分析染色體微缺失微重復異常及相關并發癥。而且該項技術不需要對標本進行培養， 大大減少實驗人員操作時間及流程，可以很快向患者告知診斷結果[6]。 本研究對140 例產前超聲提示神經系統發育異常，伴或不伴其他系統結構異常的胎兒標本采用染色體微陣列分析技術進行全面系統分析，探討CMA 在神經系統發育胎兒產前診斷中的應用價值， 現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018 年1 月至2019 年6 月因產前超聲提示胎兒表現為神經系統發育異常至江西省婦幼保健院產前診斷科行侵入性產前診斷的孕婦，共計140 例，根據是否合并其他系統結構異常， 將胎兒樣本分為單純神經系統發育異常胎兒組和復合神經系統發育異常胎兒組。 所有孕婦行手術之前均簽署產前診斷知情同意書， 明確手術流程、手術風險及染色體微陣列分析技術、染色體核型分析技術的意義、局限性，產前診斷方法根據孕周不同包括羊膜腔穿刺術和臍靜脈血穿刺術。 所有標本同時進行染色體微陣列分析和細胞染色體核型分析。

1.2 研究方法 樣本采集：所有孕婦在簽署手術知情同意書的情況下，行無菌消毒，用B 型超聲波儀進行胎兒、胎盤定位，避開損傷胎兒和胎盤的位置進針，無菌抽取標本羊水或臍血。 DNA 提取：采用Qiagene DNA 提取試劑盒提取DNA。 染色體微陣列：采用美國Affy-metrix 公司750K 芯片試劑盒及美國Clontech 公司DNA 擴增試劑盒， 首先采用NspI 酶將DNA 隨機消化為短片段，并進一步連接補齊消化后產物末端。其次PCR 擴增，并利用磁珠法純化、片段化，將產物標記，后與芯片雜交，最后洗片、染色，掃描獲取數據并進一步采用Chas v4軟件進行分析及結果判讀。

1.3 統計學分析 應用統計學軟件SPSS 19.3 組與組之間t 檢驗對兩組樣本進行比較分析， 定義P<0.05 有統計學意義。

2 結果

2.1 產前診斷結果 共計140 例孕婦接受產前診斷， 染色體微陣列分析和胎兒細胞培養染色體核型分析成功率100%，根據伴或不伴其他系統結構異常分為單純神經系統發育異常胎兒組和復合神經系統發育異常胎兒組， 以下簡稱單純組和復合組。 其中單純組病例112 例，共檢出異常染色體7例：其中18 三體2 例，染色體致病性微缺失2 例，染色體致病性微重復3 例。 同時CMA 檢出6 例意義不明病例。 復合神經系統發育異常胎兒組28例，共檢出異常染色體8 例：其中18 三體4 例，21三體1 例，13 三體1 例， 染色體致病性微缺失2例。 同時CMA 檢出2 例意義不明病例。 見表1。

2.2 神經系統發育異常與染色體異常間關系 140例神經系統異常胎兒按異常病例結果分為單純脈絡膜囊腫3 例、單純側腦室增寬3 例、單純后顱窩池增寬1 例、左側脈絡膜囊腫合并室間隔缺損，左腎重復腎1 例、右側脈絡膜囊腫合并室間隔缺損1例、雙側脈絡膜囊腫合并雙側腎集合系統增寬，鼻骨骨化不全1 例、小腦蚓部稍小合并室間隔缺損1例、小腦體積稍小，左側側腦室增寬合并臍膨出1例、后顱窩池增寬合并室間隔缺損1 例、雙側腦室增寬合并膽囊區未見回聲，室間隔缺損1 例、透明隔缺如，胼胝體發育不良合并室間隔缺損1 例。 染色體核型分析發現異常病例共10 例，染色體微陣列分析發現異常病例共15 例。 見表2。

3 討論

目前，我國新生兒出生缺陷發生率約為5.6%，隨著人口出生增加， 每年新增缺陷出生兒病例總數不斷上漲[7]。 為降低先天出生缺陷的發生，世界衛生組織提出了出生缺陷的“三級預防”策略，出生缺陷的預防分為三級，其中二級預防[8]是指“早期發現、早期診斷、早期治療”，其中早期診斷是指在胎兒出生前，通過產前篩查、產前診斷等手段對胎兒先天性缺陷進行診斷， 及早發現胎兒可能存在的先天缺陷，及早采取宮內治療、終止妊娠等干預措施。 產前診斷[9]是妊娠期預防先天出生缺陷的重要措施，隨著醫療事業的進步發展，臨床產前診斷技術不斷完善提高， 在診斷先天缺陷中應用廣泛、效果明顯，能從根本上控制出生缺陷兒數量，對提高人口素質有著重要的意義[10]。

表1 產前診斷結果

表2 神經系統發育異常與染色體異常間關系

本研究對超聲提示神經系統發育異常， 伴或不伴其他系統結構異常的胎兒進行產前診斷，同時運用染色體微陣列分析技術和傳統G-顯帶染色體核型分析技術。 研究結果顯示染色體核型分析發現10 例異常核型， 染色體異常的檢出率為7.1%，染色體微陣列分析發現15 例異常核型，染色體異常的檢出率為10.7%，較染色體核型分析另檢出5 例致病性CNVs 胎兒樣本， 包括3 例B 超提示胎兒雙側側腦室增寬，1 例B 超提示胎兒后顱窩池增寬，1 例B 超提示胎兒雙側腦室增寬合并膽囊區未見回聲、室間隔缺損，染色體致病性拷貝數變異片段大小不等，均未能被傳統G-顯帶染色體核型分析技術識別。因此，CMA 技術可以一定程度上彌補傳統G-顯帶染色體核型分析的不足，能夠更好的提高神經系統胎兒染色體異常的檢出率。

傳統G 顯帶染色體核型分析僅能檢出5～10 Mb 以上的異常。 而染色體微陣列分析可識別約400 Kb 左右的不平衡拷貝數變異。研究表明，在胎兒超聲結構異常而染色體核型分析結果正常的病例中，6%被檢出染色體致病性拷貝數變異，而在胎兒超聲和染色體核型分析結果都正常的病例中，1.7% 被檢出染色體拷貝數變異[11]，CMA 與傳統染色體核型分析相比，可發現更多異常病例[12]，因此，CMA 被美國婦產科協會等廣泛推薦用于診斷胎兒心臟結構異常、神經系統發育異常如顱腦畸形等[13-15]。 本研究顯示，1 例B 超提示胎兒單純后顱窩池增寬[16]，染色體分析核型結果提示正常，而CMA 結果提示Xp22.2 存在640.49Kb 重復，如此小片段的致病性CNVs 并不能被傳統染色體核型分析所識別，因此，臨床應用中，CMA 更能深入了解胎兒異常的遺傳背景，提供更有臨床意義的遺傳咨詢。

CNVs 即拷貝數變異，現階段常用的檢測方法為染色體微陣列或CNV 測序，DNA 拷貝數有異常，也并不表明該個體表型有異常，根據2019 年美國醫學遺傳學學會[17]對結構拷貝數變異的解釋，結合多方面的評分體系：⑴引入了定量的、基于證據的評分框架； ⑵實施廣泛用于序列變異分類的五級分類系統； ⑶將基于證據的變異分類與對特定個體的潛在影響進行分離。 由于拷貝數缺失和拷貝數重復之間的顯著特性和固有差異,因此針對兩種拷貝數變異制定了單獨的評分標準,每個計分的證據類別都被標出（1A，1B 等）以便于參考。 對CNVs 的結果分成五類: 致病性 （P）、 可能致病（LP）、不確定臨床意義（VUS）、可能是良性的、良性（LB）。 其中致病性CNVs 包括：⑴與多個同行評審出版物報道具有一致臨床表型的CNVs，即使存在外顯不全和可變表達，但其外顯和表達證據充分；⑵與已知的劑量敏感區完全重疊的獨特CNVs；⑶多基因CNVs，其中已知至少一個基因具有劑量敏感性，即使其他基因的意義不確定。

本研究有1 例病例產前胎兒彩超提示單純側腦室增寬，CMA 結果提示6q27 區段2.3Mb 的缺失， 該區段包含THBS2、PHF10、TCTE3、WDR27、C6orf70、DLL1 基因等,根據ACMG 判讀指南，該缺失判讀為致病性變異。 有文獻報道報道，在12 名患者中均檢出6q27 區域缺失一個拷貝，且缺失區域均覆蓋大小為1.2Mb 的熱點缺失區域， 該區域包 含 THBS2、 PHF10、TCTE3、DLL1、WDR27 和C6orf70 基因。 患者的主要臨床表現包括腦發育異常、腦室周圍結節狀異位、胼胝體發育不全、空洞腦、小腦發育不全、多小腦回等[18]。 另據Peddibhotla 報道，在7 例患者中均檢出6q27 區域的缺失一個拷貝， 且缺失區域均覆蓋大小為1.7Mb 的熱點缺失區域， 該區域包含THBS2、PHF10、DLL1 和C6orf70 基因。 所有患者均表現為腦結構異常[19]。

140 例神經系統發育異常胎兒的孕婦中，單純神經系統發育異常胎兒組112 例： CMA 檢出6 例意義不明病例， 檢出率5.4%（6/112）。 復合神經系統發育異常胎兒組28 例： CMA 檢出2 例意義不明病例，檢出率7.1%（2/28）。 隨著CMA 技術的發展進步，分辨率、檢出率隨之增加，因此臨床意義不明確的CNVs 的檢出率也隨之提高。意義不明病例不僅增加了產前門診咨詢的難度， 也使孕婦及其家屬產生焦慮情緒， 醫生并不能明確告知患者胎兒的預后。 目前不同國家的學術指南對于CMA臨床意義不明結果的報道和解釋存在尚爭議[20]。我國針對此情況主要是通過采取父母外周血行CMA比對，協助解釋不明確CNVs 的性質，從而降低臨床意義不明確的CNVs 的檢出率。

本研究通過探討分析染色體微陣列分析技術(CMA)在神經系統發育異常胎兒中的應用，發現與傳統染色體核型分析相比較， 染色體微陣列分析技術在異常胎兒的產前診斷中，檢出率明顯提高。但本研究的研究樣本較小， 對胎兒神經系統發育異常產前診斷的臨床價值仍需作進一步的深入研究。