羊支原體肺炎膠體金免疫層析檢測方法的建立及應(yīng)用

王 璇，潘淑惠，吳玙彤，黃 波，劉顯明，宮 偉，文正常

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005；2.貴州省威寧縣動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 威寧 553100；3.貴州省威寧縣畜禽品種改良站，貴州 威寧 553100)

羊支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPSG) 是由綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Movi)、絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri，Mmc)和山羊支原體山羊亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum，Mcc)等病原引起的傳染病[1]。在氣溫驟變或長途運(yùn)輸應(yīng)激時(shí)，較常暴發(fā)和流行[2]。根據(jù)貴州省畜牧獸醫(yī)研究所對貴州部分地區(qū)非免疫羊群的羊支原體肺炎血清學(xué)調(diào)查表明[3]，羊支原體肺炎已成為影響貴州肉羊養(yǎng)殖的主要傳染性疫病。目前，貴州肉羊?qū)I(yè)規(guī)模化養(yǎng)殖相對滯后，大部分地區(qū)仍以農(nóng)戶小規(guī)模分散養(yǎng)殖為主，其分布主要在邊遠(yuǎn)山區(qū)。本試驗(yàn)應(yīng)用綿羊肺炎支原體RPS11基因重組蛋白為免疫抗原，制備了羊支原體肺炎特異性單克隆抗體，并建立了羊支原體肺炎膠體金免疫層析檢測方法。研制的金標(biāo)檢測試紙條經(jīng)特異性、敏感性、重復(fù)性等試驗(yàn)結(jié)果表明，對羊支原體肺炎的診斷檢測具有快速、靈敏、特異及操作簡便的良好特性，其使用不需要特殊的檢測儀器設(shè)備及試驗(yàn)條件，適宜養(yǎng)羊生產(chǎn)一線對羊支原體肺炎的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查工作的開展。

1 材料與方法

1.1 重組蛋白抗原 抗原為綿羊肺炎支原體RPS11基因重組質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌菌株表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化的pET28a-RPS11蛋白，抗原表位集中區(qū)重組蛋白分子質(zhì)量為19 kDa，重組蛋白純度>85%，由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室制備保存。

1.2 待檢抗原 Mmc和 Mcc由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室保存；羊支原體肺炎ELISA診斷試劑盒為貴州省畜牧獸醫(yī)研究所中試產(chǎn)品；豬肺炎支原體、雞滑液支原體、大腸桿菌、沙門菌及鏈球菌，均購自青島立見生物公司；陰性山羊血清，購自廣州蕊特生物科技有限公司。

1.3 單克隆抗體的制備 將pET28a-RPS11重組蛋白作為免疫抗原，參照何昭陽等[4]方法制備單克隆抗體，用Protein G-瓊脂糖親和層析柱(HiTrap Protein G，1 mL，Pharmacia Biotech)對所制備的單抗進(jìn)行純化，冷凍保存。

1.4 膠體金免疫層析方法的建立

1.4.1 膠體金溶液的制備 取0.01% 四氯合金酸水溶液100 mL加熱煮沸，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液2.5 mL煮沸至橙紅色，制備成20 nm的膠體金顆粒溶液。

1.4.2 膠體金最適pH的確定 取7支1.5 mL EP管，分別加入1 mL制備好的膠體金溶液，用0.2 mol/L 碳酸鉀溶液將膠體金溶液的pH分別調(diào)為6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，取50 μL 1 mg/mL 的RPS11標(biāo)記單抗溶液加入上述膠體金管中，混勻后室溫放20 min，然后每管分別加入100 μL 10% NaCl溶液，混勻，室溫靜置1～2 h，觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH。

1.4.3 標(biāo)記抗體最適量的選擇 采用蛋白梯度法確定RPS11標(biāo)記單克隆抗體與膠體金結(jié)合的最適濃度。具體操作：取8支1.5 mL EP管，分別加入1 mL 調(diào)到最適pH的膠體金溶液，將RPS11標(biāo)記單克隆抗體用純化水稀釋成1 mg/mL，各取0、5、10、20、30、40、60 μL和80 μL按順序加入上述小試管中混勻，放置10 min后，在每一小試管中加入0.1 mL 10% NaCl水溶液，室溫混勻靜置2 h，觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低蛋白質(zhì)用量。

1.4.4 膠體金探針的制備和純化 將最適pH的膠體金溶液20 mL加入RPS11標(biāo)記單克隆抗體，在室溫下電磁攪拌30 min，制得膠體金-抗體結(jié)合物溶液，將10% BSA 2 mL加入制得的膠體金-抗體結(jié)合物溶液中(終濃度0.4%)，室溫?cái)嚢?0 min，20 000g離心40～ 60 min，仔細(xì)吸出上清，將沉淀物溶于2 mL 1% BSA的PB液中重懸，用0.45 μm濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 膠體金-抗體結(jié)合物原液工作濃度的確定和金標(biāo)墊的制備 用工作液將膠體金-抗體結(jié)合物原液按1∶2、1∶4、1∶8 與1∶16進(jìn)行稀釋，取1.4 mL膠體金-抗體結(jié)合物稀釋液，均勻地加在玻璃纖維膜上，置37 ℃烤干，即為金標(biāo)墊，測試后確定膠體金標(biāo)記抗體的最適工作濃度。

1.4.6 檢測線(T線)及質(zhì)控線(C線)條件的建立和優(yōu)化 將NC膜上T線及C線的包被抗體設(shè)置幾個(gè)濃度梯度，選擇顯色效果最優(yōu)的一組作為RPS11單克隆抗體使用濃度(T線)和羊抗鼠IgG抗體使用濃度(C線)。

1.4.7 T線及C線的點(diǎn)膜 用0.01 mol/L pH 8.0 PBS 將鼠RPS11單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體分別稀釋至所需濃度，用劃膜機(jī)在NC膜上點(diǎn)膜。T線與C線的距離為0.5 cm，參數(shù)均為1 μL/cm，噴好的NC膜置37～45 ℃烤干，干燥8 h以上。

1.5 膠體金試紙條的組裝和結(jié)果判定

1.5.1 組裝 將PVC底板切成2.8 mm×6 cm的條，在PVC底板中間粘貼抗體固相NC膜，距離上段1.5 cm，在PVC底板下端(即靠近NC膜的T線端)粘貼玻璃纖維膜探針條帶，并與固相抗體NC膜重疊0.1 cm，然后在下端粘貼1.7 cm寬樣本墊(玻璃纖維膜)與探針條帶重疊0.1～0.2 cm，在PVC底板上端(即靠近NC膜的C線端)粘貼1.7 cm寬的吸水紙，并與抗體固相NC膜重疊0.1～0.2 cm，切成2.8 mm寬的試紙條。

1.5.2 結(jié)果判定 將隨機(jī)抽取的試紙條檢測卡，向加樣孔中滴加60 μL處理好的待檢樣品，室溫下反應(yīng)15 min。結(jié)果判定方法如圖1。

圖1 膠體金試紙條的測試結(jié)果判定Fig.1 Determination of test results of colloidal gold test strip

1.6 膠體金試紙條的應(yīng)用 從特異性、敏感性和重復(fù)性對試紙條進(jìn)行評估。并將180份臨床血清樣品用試紙條和羊支原體肺炎ELISA診斷試劑盒進(jìn)行檢測，比較2種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體的制備 經(jīng)細(xì)胞融合獲得2株能夠穩(wěn)定分泌抗RPS11重組蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3G9和1B6。經(jīng)動物體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)制備2株腹水型單抗，用已建立的間接ELISA方法測得純化的單抗效價(jià)均高于105。亞型檢測鑒定結(jié)果顯示，3G9和1B6均為單一亞型IgG1；ELISA特異性檢測試驗(yàn)結(jié)果顯示，獲得的2株單克隆抗體只與RPS11重組蛋白抗原呈反應(yīng)陽性，而與其他比較菌株抗原蛋白無交叉反應(yīng)，表明獲得的單克隆抗體具有較高的特異性。

2.2 膠體金免疫層析方法的建立 經(jīng)測定，當(dāng)pH為7.5時(shí)，溶液顏色與膠體金溶液最為接近(表1)，且膠體金的穩(wěn)定性最好。因此，確定膠體金的最適pH為7.5。經(jīng)蛋白梯度法試驗(yàn)顯示，鼠RPS11單克隆抗體穩(wěn)定1 mL膠體金所需的最小抗體量為10 μg/mL。在1 mL膠體金-抗體結(jié)合物溶液中加入10% NaCl水溶液1 mL后，溶液仍為無沉淀的紫紅色液體，說明制得的膠體金-抗體結(jié)合物原液具有良好的穩(wěn)定性。經(jīng)試驗(yàn)測試結(jié)果顯示，當(dāng)膠體金-抗體結(jié)合物原液的工作濃度為1∶4時(shí)，制得的金標(biāo)墊檢測效果最佳。對NC膜上T線及C線的包被抗體設(shè)置幾個(gè)濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，檢測顯色效果最優(yōu)的一組濃度為：鼠RPS11單克隆抗體(T線上)工作濃度2 mg/mL，羊抗鼠IgG抗體(C線上)工作濃度為1 mg/mL。

表1 膠體金標(biāo)記最適pH測定Table 1 Determination of optimum pH marked by colloidal gold

2.3 膠體金試紙條的結(jié)果判定 隨機(jī)抽取試紙條，對RPS11標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品和標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2，說明制備的試紙條有效。

圖2 試紙條檢測結(jié)果判定Fig.2 Determination of test strip test results

2.4 膠體金試紙條的應(yīng)用

2.4.1 試紙條的特異性 用試紙條對重組蛋白表達(dá)菌株等進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示，說明試紙條對重組蛋白具有較好特異性。分別用Mmc、Mcc、豬肺炎支原體、雞滑液支原體、大腸桿菌、沙門菌及鏈球菌代替綿羊支原體肺炎支原體，對試紙條特異性進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，Mmc、Mcc、豬肺炎支原體、雞滑液支原體、大腸桿菌、沙門菌、鏈球菌和標(biāo)準(zhǔn)綿羊肺炎支原體陰性樣品僅在C線出現(xiàn)1條玫瑰紅線；標(biāo)準(zhǔn)綿羊肺炎支原體陽性樣品出現(xiàn)T線、C線2條玫瑰紅線，說明綿羊支原體肺炎RPS11單抗膠體金試紙條不與Mmc、Mcc、豬肺炎支原體、雞滑液支原體、大腸桿菌、沙門菌及鏈球菌發(fā)生交叉反應(yīng)。

圖3 試紙條對重組蛋白表達(dá)菌株的特異性檢測Fig.3 Specific detection of test strip for recombinant protein expression strain1：空載體(質(zhì)粒)；2：宿主菌株全菌蛋白；3：空載體轉(zhuǎn)染菌株全菌蛋白；4：IPTG誘導(dǎo)前菌株全菌蛋白；5：IPTG誘導(dǎo)后菌株全菌蛋白；6：純化后重組蛋白1:Empty vector;2:Whole cell protein of host strain;3:Empty vector was transfected into the whole bacterial protein;4:Whole cell protein of strain before IPTG induction;5:Whole bacterial protein induced by IPTG;6:Purified recombinant protein

2.4.2 試紙條的敏感性 將陽性抗原1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀釋，用試紙條進(jìn)行檢測，最低可檢出1∶1 000倍稀釋的陽性抗原(濃度為3.0 mg/mL)(圖4)。

圖4 試紙條的敏感性Fig.4 Sensitivity of test strip1：陽性抗原1∶10；2：陽性抗原1∶100；3：陽性抗原1∶1 000；4：陽性抗原1∶10 000；5：陰性對照1:Positive antigen 1∶10;2:Positive antigen 1∶100;3:Positive antigen 1∶1 000;4:Positive antigen 1∶10 000;5:Negative control

2.4.3 試紙條的重復(fù)性 4批次試紙條檢測5份羊支原體肺炎陰性樣品和羊支原體肺炎陽性樣品，每個(gè)樣品重復(fù)檢測10次，檢測結(jié)果完全一致，不同批次間、同一批次內(nèi)檢測結(jié)果完全一致。

2.4.4 試紙條的臨床應(yīng)用 應(yīng)用建立的膠體金試紙條和羊支原體肺炎ELISA診斷試劑盒分別對180份生產(chǎn)場臨床血清樣本進(jìn)行檢測(表2)。結(jié)果表明，膠體金試紙條檢測陽性率為35.00%，陰性率為65.00%；ELISA陽性率為29.44%，陰性率為70.56%；兩者陽性符合率為94.34%，陰性符合率為89.76%，總符合率達(dá)91.11%。

表2 180份臨床血清膠體金試紙條與ELISA檢測比較Table 2 Test comparison of 180 clinical serum colloidal gold test strips and ELISA test

3 討論

膠體金免疫層析技術(shù)是20 世紀(jì)90 年代發(fā)展起來的一種以膠體金作為標(biāo)記物檢測特定抗原或抗體的新型固相免疫標(biāo)記技術(shù)[5-6]。因該技術(shù)具有特異性、操作簡便、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，其在獸醫(yī)臨床上有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。本試驗(yàn)建立的羊支原體肺炎膠體金檢測試紙條，具有較好的檢測特異性，與ELISA試驗(yàn)方法相比，兩者符合率達(dá)91.11%，與其他學(xué)者建立的膠體金試紙條檢測符合率的結(jié)果相符[7-10]。膠體金適用于無實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的任何場景，檢測時(shí)間短，適用于大量樣本的初步篩查，可與ELISA或PCR聯(lián)合使用，更利于疫病的及時(shí)、準(zhǔn)確診斷。

本試驗(yàn)制備的鼠RPS11標(biāo)記單克隆抗體免疫抗原為綿羊肺炎支原體基因重組質(zhì)粒pET28a-RPS11純化蛋白，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)和增強(qiáng)宿主免疫應(yīng)答的功能[11-13]。制備的鼠RPS11標(biāo)記單克隆抗體與常規(guī)抗體相比較，具有單一的特異性，可與綿羊肺炎支原體選擇性RPS11基因抗原決定簇發(fā)生特異性反應(yīng)，且重復(fù)性較好。試驗(yàn)制備的膠體金檢測診斷試劑，生產(chǎn)實(shí)際操作中，不需要特殊檢測儀器，特別適合廣大的基層獸醫(yī)人員用于羊支原體肺炎的診斷及批量檢測工作。

羊支原體肺炎的主要病原為Movi、Mmc和Mcc，本試驗(yàn)制備的膠體金試紙條特異性針對Movi，關(guān)于Mmc和Mcc的膠體金檢測試驗(yàn)，有待進(jìn)一步研究。