新型季銨鹽戊二醛消毒液殺菌效果評價

何淑華，許 琦，林曉雁，盧朝成，傅江南，和 君

(1.暨南大學實驗動物管理中心，廣東 廣州 510632；2.成都中牧生物藥業(yè)有限公司，四川 成都 610100)

消毒工作是實驗動物管理的關鍵環(huán)節(jié)，是實驗動物工作的基礎保障。從業(yè)人員只有使用正確配比的消毒劑才能達到消毒效果，才能在生產、試驗過程中把控實驗動物的質量，規(guī)范實驗動物的安全管理[1]。因此，消毒工作是控制環(huán)境中病原的關鍵。目前，實驗動物屏障環(huán)境中常見的消毒劑種類包括含氯類、過氧化物類、醛類、醇類和季銨鹽類消毒劑[2]。單一消毒劑易受微生物的種類、使用濃度、環(huán)境中有機物等因素的影響而不能達到預期的效果，復合型消毒劑可避免此類問題達到好的殺滅效果[3-4]。本試驗對一種新型三組方季銨鹽戊二醛消毒劑進行殺菌效果評價，選用4種常用消毒劑進行噴霧消毒對比試驗[5]；與復合過氧乙酸進行懸液定量殺菌對比試驗。本試驗結果對實驗動物設施的消毒劑選擇及有效配比提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗組消毒液 復合過氧乙酸 (Compound peracetic acid disinfectant,CPAA)，有效成分：過氧乙酸30～60 g/L、過氧化氫220～280 g/L；季銨鹽戊二醛 (Quaternary ammonium salt glutaraldehyde disinfectant,QASG)，主要成分：苯扎氯銨16 g/L、癸甲溴銨24 g/L、戊二醛20 g/L，用前加無水碳酸鈉20 g/L進行堿化；漂白水，主要成分：次氯酸鈉和氫氧化鈉；微酸性次氯酸，有效氯含量60～80 mg/L；乙醇，含量為(950±50) mL/L。以上產品均為市售產品。

1.1.2 菌種 大腸埃希菌 ATCC 8099、金黃色葡萄球菌 ATCC 6538、綠膿桿菌 ATCC 15442、白色念珠菌 ATCC 10231，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑 胰蛋白胨大豆肉湯 (TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂 (TSA)、液體沙氏培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；標準硬水、胰蛋白胨生理鹽水溶液 (TPS)、3%牛血清白蛋白 (BSA)，參照 《消毒技術規(guī)范》[5](簡稱《規(guī)范》) 配制；復合過氧乙酸和季銨鹽戊二醛的中和劑參照文獻[6-7]。

1.2 方法

1.2.1 噴霧消毒試驗 取普通環(huán)境實驗室桌面自然菌接種于TSB，37 ℃培養(yǎng)18 h，稀釋麥氏比濁度 (McF) 為0.5的菌懸液，104倍稀釋，取0.2 mL/皿涂布于TSA制成染菌皿 (染菌量250～300 CFU/皿)。5種消毒劑參照說明書的最高消毒濃度 (復合過氧乙酸1∶24倍稀釋、季銨鹽戊二醛1∶100倍稀釋、漂白水6∶190倍稀釋、微酸性次氯酸原液、乙醇100∶26倍稀釋) 進行噴霧試驗，為確保噴霧消毒劑量的一致性，以固定噴頭、噴灑距離來實現。37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，計算菌落數，按下式計算殺滅率 (%)。

殺滅率= (試驗組菌落數-陽性對照菌落數)/陽性對照菌落數×100%

1.2.2 試驗菌懸液的制備 參照 《規(guī)范》，復蘇菌種培養(yǎng)至3代，分別取E.coil、S.aureus、P.aeruginosa單菌落接種TSA斜面37 ℃培養(yǎng)24 h；C.albicans接種于PDA斜面26 ℃培養(yǎng)48 h。用TPS洗脫斜面培養(yǎng)物，使各菌為E.coil1.9 McF、S.aureus2.0 McF、P.aeruginosa2.1 McF、C.albicans6.9 McF。

1.2.3 活菌培養(yǎng)計數 參照 《規(guī)范》將E.coil、S.aureus、P.aeruginosa在TSA中37 ℃培養(yǎng)48 h，C.albicans在PDA中26 ℃培養(yǎng)72 h，計算菌濃度 (CFU/mL)。

1.2.4 中和劑鑒定試驗 以E.coil和C.albicans為試驗菌，室溫下按中和劑懸液定量鑒定試驗設計6組，參照《規(guī)范》進行試驗：第1組 (消毒液+菌懸液)；第2組 (消毒液+菌懸液+中和劑)；第3組 (中和劑+標準硬水+菌懸液)；第4組 (中和產物+菌懸液)；第5組 (TPS+標準硬水+菌懸液)；第6組 (TPS+中和劑+標準硬水)。試驗重復3次，計算各組的菌落數，按下式計算第3、4、5組間菌落數誤差率。

Pz=(∑︱X-Xi︱)÷(∑Xi)×100%

Pz：組間菌落數誤差率；X：3組間菌落平均數；Xi：各組菌落平均數

1.2.5 懸液定量殺菌試驗 參照《規(guī)范》，室溫下比較復合過氧乙酸和季銨鹽戊二醛不同濃度下對E.coil、S.aureus、P.aeruginosa和C.albicans的定量殺菌效果。消毒液的稀釋度為 1∶100、1∶500和1∶1 000，消毒液與標準硬水以 1.25∶100、1.25∶500 和 1.25∶1 000 配制。0.5 mL 菌懸液和 0.5 mL 3%BSA 混勻后加入 4 mL 配制濃度的消毒液，混勻30 min 后，取 0.5 mL 試驗菌、消毒混合液加入4.5 mL中和劑中，混勻作用10 min，取 1 mL 該樣液計算菌落數，試驗獨立重復3次；同時設立對照組。計算殺滅對數值 (KL)。

KL=lg(T0)-lg(Tx)

KL：殺滅對數值；T0：陽性對照組平均活菌濃度；Tx：試驗組平均活菌濃度

1.2.6 pH測定 參照《規(guī)范》“pH測定法”測定復合過氧乙酸及季銨鹽戊二醛的不同稀釋度的pH。

2 結果

2.1 噴霧消毒 噴霧試驗結果顯示(見中插彩版圖1)，季銨鹽戊二醛 1∶100倍稀釋和復合過氧乙酸 1∶24倍稀釋的殺滅率均為100%，漂白水 6∶190倍稀釋、微酸性次氯酸原液、乙醇 100∶26倍稀釋的殺滅率分別為59%、37%和50%。

圖1 5種消毒劑噴霧后表面菌落的生長情況Fig.1 Growth of surface colonies after spraying five disinfectantsA：陽性對照；B：漂白水；C：季銨鹽戊二醛；D：微酸性次氯酸；E：乙醇；F：復合過氧乙酸A:Positive control;B:Bleach;C:QASG;D:Slightly acidic hypochlorous acid;E:Ethanol;F:CPAA

2.2 中和劑鑒定 參照《規(guī)范》和趙斌秀等[8]發(fā)表的中和劑合格標準，1組無菌生長，2組比1、3、4、5組菌數量顯著減少，3、4、5組間菌落數誤差率不超過15%，6組無菌生長，中和劑鑒定合格，結果見表1。所用中和劑均能有效中和消毒液，且中和劑、中和產物對E.coil和C.albicans均無影響。

表1 中和劑鑒定試驗結果Table 1 Results of neutralization identification test (n=3)

2.3 懸液定量殺菌 由表2所示，復合過氧乙酸1∶1 000 倍稀釋對E.coil、S.aureus、P.aeruginosa的殺滅對數值均>7；季銨鹽戊二醛 1∶1 000 倍稀釋對S.aureus的殺滅對數值>7，1∶500倍稀釋對E.coil殺滅對數值>7，1∶100 倍稀釋對P.aeruginosa的殺滅對數值>7；復合過氧乙酸和季銨鹽戊二醛 1∶500 倍稀釋對C.albicans的殺滅對數值均>6。參照 《規(guī)范》 要求，細菌繁殖體的殺滅對數值≥5、真菌的殺滅對數值≥4，判定為消毒合格。因此，季銨鹽戊二醛 1∶100 倍稀釋，復合過氧乙酸 1∶500 倍稀釋對所測菌株殺滅效果均可達100%，消毒合格。

表2 懸液定量殺菌試驗結果Table 2 Results of suspension quantitative sterilization test

2.4 pH測定 由表3所示，季銨鹽戊二醛原液呈酸性，使用前每升原液需加入20 g無水碳酸鈉進行堿化，使pH達到9.7～10.0，該液的工作濃度pH在7.4～9.8；復合過氧乙酸原液呈酸性，工作濃度的pH范圍在2.6～3.5。

表3 不同稀釋度消毒液的pHTable 3 pH of disinfectant with different dilution

3 討論

動物設施中，人源、動物源、物源使用不規(guī)范或管理不當均可造成外源物的污染。因此，嚴格做好消毒工作是保證實驗動物設施潔凈，獲得的試驗數據真實可靠的關鍵。本試驗選用常用的復合過氧乙酸、漂白水、微酸性次氯酸、乙醇消毒液，與季銨鹽戊二醛進行噴霧消毒對比試驗。結果顯示，復合過氧乙酸1∶24倍稀釋和季銨鹽戊二醛1∶100倍稀釋的殺滅率均為100%。進一步以復合過氧乙酸和季銨鹽戊二醛進行定量殺菌效果比較。結果顯示，季銨鹽戊二醛1∶100倍稀釋和復合過氧乙酸1∶500倍稀釋對各試驗菌殺滅效率高達100%。

圖2 懸液定量殺菌試驗菌落生長情況Fig.2 Colony growth in suspension quantitative sterilization testP：陽性對照組；A、B、C：分別為復合過氧乙酸1∶100、1∶500、1∶1 000的稀釋液試驗組；D、E、F：分別為季銨鹽戊二醛1∶100、1∶500、1∶1 000的稀釋液試驗組P:Positive control group;A,B,C:CPAA’s dilution test groups 1∶100,1∶500,1∶1 000;D,E,F:QASG’s dilution test groups 1∶100,1∶500,1∶1 000

復合型季銨鹽戊二醛由苯扎氯銨、癸甲溴銨和戊二醛三方組成。戊二醛屬于醛類高效消毒劑，可抑制RNA、DNA和蛋白質合成，殺滅各種微生物；苯扎氯銨、癸甲溴銨是常用的單、雙鏈季銨鹽類陽離子表面活性劑，具有良好的殺菌作用[9]。復合型季銨鹽戊二醛降低了單一組分的用量，同時達到提高消毒效果、提升穩(wěn)定性、減少副作用的目的[10]。同時，這類消毒劑在酸性條件下穩(wěn)定儲存，在堿性條件下殺滅效果好[3-4]，符合理想的化學消毒劑殺菌譜廣、高效、低毒、低腐蝕、穩(wěn)定的優(yōu)點。

本試驗在實驗室條件下，檢測了季銨鹽戊二醛的殺滅效果，殺滅率依次為：金黃色葡萄球菌>大腸埃希菌>銅綠假單胞菌，與魏嵐[11]的研究結果一致，殺滅效果符合實驗室殺滅微生物試驗的消毒要求[5]。本試驗為各實驗動物設施消毒液的選擇提供依據，并為有針對性殺滅病原體提供參考。