2種伊維菌素澆潑劑在牛體內(nèi)的藥動學(xué)比較試驗

陸 靜，袁慧平，李榮順，呼和巴特爾，黃顯會

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.金河生物科技股份有限公司，內(nèi)蒙古 托克托 010200；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

伊維菌素(Ivermectin,IVM)是大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥，屬于阿維菌素(Avermectins，AVMs)家族中的一員，具有廣譜、高效、用量小和安全的優(yōu)點[2]，對多種寄生性線蟲、體外寄生蟲具有較好的驅(qū)殺作用[3]，與其他抗寄生蟲藥無交叉耐藥性[4]，臨床上常用于治療牛、羊、駱駝、豬等多種畜禽的寄生蟲病，是國內(nèi)外公認(rèn)的一種新型、廣譜、高效、低毒、副作用小的抗寄生蟲藥[5]。伊維菌素澆潑劑是一種新型透皮吸收劑，該藥經(jīng)背部皮膚施藥后，使伊維菌素通過皮膚吸收進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)而發(fā)揮全身療效，能夠有效地驅(qū)殺體內(nèi)外寄生蟲，該劑型具有操作方便[6-7]，對動物的驚擾少等優(yōu)點，在國外許多國家得到了廣泛的應(yīng)用。然而，時至今日在我國還沒有用于牛的商品化伊維菌素澆潑劑，為了驗證研制的伊維菌素澆潑劑與國外同類產(chǎn)品在藥代動力學(xué)方面的差異，本試驗采用雙周期交叉試驗設(shè)計方案，通過澆潑給藥的方式，對研制的伊維菌素澆潑劑(0.5%)和美國某公司生產(chǎn)的(Ivermectin)POUR-ON for Cattle(0.5%)進(jìn)行了牛體內(nèi)的藥動學(xué)對比研究，旨在對研制的伊維菌素澆潑劑進(jìn)行客觀、科學(xué)地評價。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg/安瓿，含量96%，批號：CA14488000，德國Dr.Ehrenstorfer公司。供試藥物：伊維菌素澆潑劑,含量0.5%，批號：201007001，內(nèi)蒙古某動物藥業(yè)有限公司。參比藥物：POUR-ON for Cattle(Ivermectin),含量0.5%，批號：26865，美國某公司生產(chǎn)；乙腈、甲醇：色譜純，F(xiàn)isher公司；三氟乙酸酐：含量99%，F(xiàn)luka公司；N-甲基咪唑：含量99%，TCI公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備 旋渦混合儀，型號XW-80A，購自上海青浦滬西儀器廠；軌道式搖床，型號KS501 digital，購自德國IKA公司；超高效液相色譜儀(配熒光檢測器、四元泵、脫氣泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱等)，購自美國Waters公司；高速冷凍離心機(jī)，購自美國Thermo公司等。

1.3 試驗動物 10頭蒙古黃牛，在呼和浩特市托克托縣匯豐奶牛養(yǎng)殖小區(qū)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 給藥與分組 采用雙周期交叉試驗設(shè)計方案[8]，2011年6月第1輪試驗：8頭牛隨機(jī)分成3組，分別為內(nèi)蒙古某動物藥業(yè)有限公司的伊維菌素澆潑劑推薦劑量組試驗牛3頭；美國某公司(Ivermectin)POUR-ON for Cattle組推薦劑量組試驗牛3頭；空白對照組試驗牛2頭。2012年3月第2輪試驗：6頭牛隨機(jī)分成2組，分別為內(nèi)蒙古某動物藥業(yè)有限公司的伊維菌素澆潑劑推薦劑量組試驗牛3頭；美國某公司(Ivermectin)POUR-ON for Cattle組試驗牛3頭。澆潑劑施藥方法為沿牛背部脊柱由肩部至尾根部澆潑給藥。給藥前對各試驗牛逐個進(jìn)行體重計算[按內(nèi)蒙古自治區(qū)標(biāo)注計量局(1989-11-30批準(zhǔn))的牛體重計算標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行]，方法如下：體重(kg)=[(胸圍2×體斜長)/10 800]±30 kg。給藥劑量為500 μg/(kg·bw)。

1.5 血樣采集 給藥前采空白血液，分別于給藥后2、4、12 h，1、2、3、5、9、15、23、33、45、60 d采集血樣。牛只站立式保定，頸靜脈采血，每次采血10 mL左右，置于含肝素的離心管中，4 000 r/min離心10 min，分離血漿，于-20 ℃冰箱保存。

1.6 樣品前處理 從冰箱中取出血漿，自然解凍，搖勻。準(zhǔn)確量取血漿1.0 mL，加入10 mL離心管中，然后加入1 mL乙腈與0.25 mL水，10 000 r/min渦旋1 min，搖床振蕩15 min后8 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)入C18固相萃取小柱。柱子先用3 mL甲醇活化，3 mL水平衡，取上清液過柱，用3 mL 水淋洗后，用2 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干(要確定完全吹干，不然會影響接下來的衍生化)。加入100 μL衍生化試劑N-甲基咪唑-乙腈(1∶1，v/v)，渦旋2～5 min，使殘留物完全溶解，再加入150 μL三氟醋酸酐-乙腈(1∶2，v/v)立即蓋上蓋子，渦旋1 min，靜置避光反應(yīng)15～20 min，加入750 μL甲醇終止反應(yīng)。待上機(jī)檢測。

1.7 高效液相色譜(HPLC)檢測 色譜工作條件如下。Waters工作站：Waters2475熒光檢測器；色譜柱：Gemini 5u C18 100A(250 mm×4.0 mm，5 μm)，美國Penomenex公司；流動相：甲醇(100%)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測器：熒光檢測器；激發(fā)波長：365 nm；發(fā)射波長：475 nm；在上述色譜工作條件下，伊維菌素與血漿中組分分離良好，伊維菌素的色譜峰保留時間分別為7.3 min左右。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 在10支15 mL離心管中各加入900 μL空白血漿，再依次加入100 μL伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(10～1 000 ng/mL)，漩渦混勻，使得各樣品中的藥物濃度為1～100 ng/mL，第1管不加藥物作對照，見表1。按照“1.6”所述進(jìn)行處理，上機(jī)測定。將IVM的色譜峰面積的平均值(A)與藥物濃度(C)作線性回歸，求得IVM標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，共做3次重復(fù)。結(jié)果見表2。

表1 伊維菌素HPLC分析標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度

表2 血漿中添加伊維菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

1.9 定量限和檢測限的測定 取空白牛血漿，添加伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，配置成濃度為0.1、0.2、0.5、1、2 ng/mL的加標(biāo)樣品(n=20)，按“1.6血漿樣品前處理方法”處理樣品，再按“1.7色譜工作條件”進(jìn)行HPLC分析測定。以最低檢出濃度計算，S/N≥3 時的加標(biāo)樣品濃度為檢測限，S/N≥10時的加標(biāo)樣品濃度為定量限。求得本方法檢測限為0.2 ng/mL，定量限為1 ng/mL，表明方法的靈敏度高，滿足藥物檢測的要求。

1.10 數(shù)據(jù)分析處理 采用美國Pharsight公司藥動學(xué)軟件 Winnonlin 5.2.1的房室模型來處理藥動數(shù)據(jù)，計算出每頭試驗牛的藥動學(xué)參數(shù)，然后計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，同時以血藥濃度平均值對時間作藥-時曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 藥代動力學(xué)參數(shù) 2011年6月第1輪試驗和2012年3月第2輪試驗中牛按500 μg/(kg·bw)澆潑給藥后，分別在不同時間點采血，樣品經(jīng)前處理后HPLC檢測，血藥濃度-時間數(shù)據(jù)見表3、表5，主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表4、表6，藥代動力學(xué)參數(shù)峰濃度(Cmax)、達(dá)峰時間(Tmax)、平均滯留時間(MRT)、藥-時曲線下面積(AUCt)、吸收半衰期(t1/2ka)、消除半衰期(t1/2kel)、吸收速率常數(shù)(Ka)、消除速率常數(shù)(Kel)、表觀分布容積/生物利用度(V/F)比較見表7，藥-時曲線見圖1。

表3 供試組試驗給藥后牛體血漿中IVM的濃度 (ng/mL)

表4 供試組IVM藥代動力學(xué)參數(shù)

表5 POUR-ON組試驗給藥后牛體血漿中IVM的濃度 (ng/mL)

表6 POUR-ON組IVM藥代動力學(xué)參數(shù)

表7 供試組IVM和 POUR-ON組IVM藥代動力學(xué)參數(shù)比較

圖1 試驗不同組別IVM血藥濃度-時間曲線圖

3 討論

藥代動力學(xué)分析是評價特定動物體內(nèi)藥物吸收、分布的重要方法，也是評價藥物不同劑型間等效性的重要手段[9-11]，本試驗對比了國內(nèi)外2種伊維菌素澆潑劑在牛體內(nèi)的藥代動力學(xué)差異，以評價國內(nèi)研發(fā)的伊維菌素澆潑劑的藥效。

牛按500 μg/(kg·bw)背部給予供試藥物和POUR-ON后，藥代動力學(xué)參數(shù)證明其可經(jīng)皮膚吸收，供試藥物組與POUR-ON組藥代動力學(xué)參數(shù)中AUCt分別為(293.62±12.09) d·ng/mL和(338.28±29.57) d·ng/mL；MRT分別為(9.71±1.74)d和(11.36±1.18)d；Cmax分別為(23.61±4.76) ng/mL和(23.09±3.90) ng/mL；Tmax分別為(4.27±0.79)d和(4.65±0.89)d；t1/2ka分別為(2.08±0.53)d和(2.33±1.22)d；t1/2kel分別為(4.72±1.63)d和(5.59±1.40)d。試驗結(jié)果表明，供試藥物組與POUR-ON組背部給藥后在牛體內(nèi)吸收和消除均迅速，除藥-時曲線下面積外，2種澆潑劑的藥代動力學(xué)參數(shù)：MRT、Tmax、Cmax、t1/2ka、t1/2kel、Ka、Kel、V/F均無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

4 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，研制的伊維菌素澆潑劑(0.5%)與美國某公司的(Ivermectin)POUR-ON for Cattle(0.5%)在牛體經(jīng)背部施藥后，均可經(jīng)皮膚吸收，吸收和消除均較快，血漿中主要藥代動力學(xué)參數(shù)：MRT、Tmax、Cmax、t1/2ka、t1/2kel、Ka、Kel、V/F差異均不顯著，2個制劑在牛體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征相似。